1、清肝開竅祛風法對電點燃模型大鼠c-fos蛋白表達的影響         【摘要】  目的 研究清肝開竅祛風法對電點燃癲癇大鼠模型的c-fos蛋白的影響。方法 將利用改良的Goddard方法造模成功的電點燃大鼠癲癇模型隨機分為五組：模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、西藥組。另取6只作為正常組，在造模成功后連續給予相應的藥物28天后進行電刺激誘發癲癇，2h后取海馬區腦組織用免疫組化法測定Fos蛋白。結果 免疫組化試驗顯示：大鼠電點燃癲癇模型大腦皮層、海馬c-fos陽性細胞較正常組表達增強，密集

2、分布，染色較深；而4個藥物治療組則表達明顯減少，分布稀疏，染色較淺。結論 清肝開竅祛風法能抑制Fos蛋白的表達，各劑量組與西藥組療效相當，但治療組各指標均未完全恢復到正常對照組水平。 【關鍵詞】  癲癇電點燃模型清肝開竅祛風法c-fos蛋白細胞凋亡癲癇是神經科的常見疾病，據統計我國每年約有6570萬新發癲癇病人，全國共有癲癇病人超過600萬,目前癲癇的治療以藥物為主，原有一線抗癲癇藥物，僅可使80%的患者發作得以控制，并有明顯的毒副作用，對行為、認知功能有負面影響，還存在不同程度的耐受性，新型二線抗癲癇藥及手術療法有其嚴格的適應證，經濟費用高昂，臨床療效難以肯定。故我們在長期的臨床基

3、礎上以清肝開竅祛風立法，采用經驗方寧癇煎劑治療癲癇，觀察該藥對電點燃模型大鼠c-fos蛋白的表達的影響，現總結如下。   1  材料與方法   1.1  實驗動物  健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，體重180220g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供（合格證號：川實動管質第9號）。   1.2  試劑  用青黛、石菖蒲、全蝎（四川省醫藥公司提供）為方，經成都中醫藥大學附屬醫院藥劑加工廠煎煮、回收揮發性成分、濃縮，制成每毫升含原生藥1g。丙戊酸鈉口服溶液（杭州賽諾菲德拉堡民生制藥有限公

4、司  H20041435）；戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司  WH20050411）；免疫組化試劑盒（北京萊博生物實驗材料研究所目錄號：LA0347）。   1.3  大鼠電癲癇模型的復制  按照李昱2造模方法，制造電點燃模型癲癇大鼠，癇性行為評定根據Racine分級法1，大鼠出現4級及以上癇性行為（包括4級），并記錄到AD即視為點燃2。   1.4  動物分組  SD大鼠自由飲水和攝食1周后，選取體重230300g大鼠造模，將造模成功的大鼠隨機分為5組：模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組

5、、中藥低劑量組各8只，西藥對照組6只。另選6只作為正常對照組。   1.5  給藥方法  模型復制成功后，觀察大鼠行為，出現一次非誘發性的癲癇發作后開始給藥，其中中藥低劑量組為成人等效量的5倍2.5g/（kg·d），中藥中劑量組為成人等效劑量的10倍5g/（kg·d），中藥高劑量組為成人等效劑量的20倍10g/（kg·d）。西藥組丙戊酸鈉以人每天20mg/kg，換算成大鼠的劑量，每天2次灌胃。造模成功后按相應組別連續用藥28天。   1.6  觀察內容及檢測指標   1.7&

6、#160; 統計學方法   Fos蛋白表達、AD值和體重用SPSS統計軟件11.5進行分析處理，采用單因素方差分析；行為觀察大鼠的癲癇發作情況用Radit分析。            2  結果   2.1  一般情況  大鼠造模后，活動明顯減少，進食進水量減少，蜷臥，時有濕狗樣抖動，毛發直立、雜亂，體重下降（消瘦），1周后，活動較上周稍增加，但活動遲緩，時有呆立，飲食較前一周增多，體重無明顯變化。給藥組治療1周后毛發較前光整

7、，精神狀態好轉，進食進水增加，活動增多，3周后活動自如，體重增加。   2.2  Fos蛋白測定   大鼠電點燃癲癇模型大腦皮層、海馬c-fos陽性細胞較正常組表達增強，密集分布，染色較深，多見褐色顆粒；而4個藥物治療組則表達明顯減少，分布稀疏，染色較淺。見表1。表1  各組大鼠c-fos蛋白表達平均灰度的比較注：與模型組比較，P0.01   3  討論   中醫認為本病的形成，大多由于先天因素、七情失調、飲食不節、勞累過度、頭顱外傷、手術或蟲體寄居，以及其他疾病之后，現代更有藥害因素

8、，造成肝、脾、腎等臟損傷，使臟腑功能失調，氣機紊亂，痰濁阻滯，瘀血瘀阻，或風陽內動所致。   黃帝內經素問·卷二十一·六元正紀大論篇第七十一曰：“木發之郁，太虛埃昏，云物以擾，大風乃至，屋發折木，木有變。故民病胃脘當心而痛，上支兩脅，膈咽不通，飲食不下，甚則耳鳴眩轉，目不識人，善暴僵仆”。素問·至真要大論病機十九條：“肝者中正之官，謀慮出焉；膽者將軍之官，決斷出焉”， 壽世保元還說“肝虛生風”，說明肝的升發太過與不及，分別導致陽升風動或虛風內動，風陽上擾或風動痰升，壅滯經絡，閉塞清竅，便發為癲癇。肝氣暴郁，魂不附體，則出現神志喪失，包括昏迷、失

9、神（短暫意識喪失）、無自主運動（自動癥）；肝氣暴郁，引動肝風，肝過主筋則出現抽筋；肝開竅于目，今肝氣暴郁，魂不附肝，目失所主則出現兩目上翻或凝視；厥陰之氣夾痰上逆則出現口吐涎沫；肝氣暴郁,則出現尖叫。肝郁化火能引動肝風，驚恐郁怒，使心肝之氣不舒，氣郁生痰，痰被肝風所動，則上擾清竅。古今醫鑒·五癇：“夫癇者原解其由，或因七情之氣郁結，或為六淫之邪所干，或因受大驚恐，神氣不守，或年歷幼受驚，感觸而成，皆是痰迷心竅，如癡如愚，治之不必分五，俱宜豁痰順氣，清火平肝”。   筆者于臨床實踐中運用清肝開竅法組方治療癲癇，療效較好，故特做此藥的基礎研究。  

10、 本試驗結果表明清肝開竅祛風法能有效地抑制癲癇大鼠腦內Fos 的表達。其機理可能包括兩方面：本方中各組成中含有多種神經細胞抑制性成分，在功能上調節海馬顆粒細胞的返回抑制中可能起重要作用，Ca2+內流受抑，直接或通過影響其他離子流而抑制神經元去極化，延緩了癲癇的發生，減輕發作強度，從而延緩或抑制了由癇性放電誘導的c-fos基因的表達;另一方面c-fos基因的表達受到鈣離子的調控。觸發電壓依賴的鈣離子內流的因素可誘導c-fos基因表達3，當神經元受刺激興奮時，鈣離子可經電壓依賴的和受體門控的鈣通道進入細胞，使神經細胞鈣超載，鈣離子與胞內鈣調素結合，直接或間接啟動c-fosmRNA轉錄4。   清肝開竅祛風法通過抑制神經元興奮，降低線粒體耗氧量等，緩解由于癲癇發作而引起的腦缺氧，鈉泵作用及鈣鈉交換下降，鈣內流，從而影響c-fos基因轉錄過程的激活，使神經細胞c-fos基因表達受到抑制。   4  結論   本試驗采用電點燃方法，建立大鼠慢性癲癇模型，模仿人的癲癇發作過程，采用免疫組化法測定c-fos蛋白，評價寧癇顆粒對癲癇的療效，研究清肝開竅祛風法對基因表達的影響，并初步探討其機理。得出結論（1） 采用改良的Goddard方法，能成功建立電點燃慢性癲癇模型，造模總成功率76%，點燃率9