1、,綜述.納米佐劑在疫苗研究中的應用侯永利綜述；吳曉此，胡四海審校南華大學病原生物學研究所，湖南衡陽421001摘要:納米佐劑(nanoparticle-basedadjuvants)是指粒徑1000nm的佐劑。與傳統(tǒng)佐劑相比，納米佐劑因具有靶向性、緩釋性、安全性及高效性等優(yōu)點而受到疫苗研究者的青睞。特別是其在免疫輔佐效果和安全性方而表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢,促進了許多新型疫苗在臨床上的廣泛應用。同時，納米佐劑可提高基因轉(zhuǎn)染效率，這一特征為核酸疫苗的應用提供r可能。現(xiàn)從納米佐劑的組成成分、作用機制、免疫輔佐效果以及臨床應用等方而對幾種極具潛力的納米佐劑作一概述。關(guān)鍵詞:納米佐劑;作用機制;輔佐效果;疫苗

2、中圖分類號：R979.5文獻標志碼：A文章編號：1005-5673(2018)05-0080-06DOI：10.13309/ki.pmi.2018.05.014ApplicationsofNanoparticle-BasedAdjuvantsonthevaccineHOUYong-li,WUXiao-xia,HUSi-haiInstitutionofPathogenicBiolo,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyeng421(X)1,HunanProvince,ChinaCorrespondingauthor:HUSi-hai,E-mail

3、:hh$hh_518Abstract:Nanoscale-basedadjuvantisanadjuvantwithaparticlesizelessthan1(XX)nm.Nanoparticle-bascdadjuvantshavebeenahotspotbecauseofitstargeting,delayedreleasing,safetyandeffectivenesscomparedwithconventionaladjuvants；especiallyfor,theimtnuncadjuvanteffectandsafetydominanceshavepromotedthenew

4、vaccinestobeusedwidely.Additionally,nanoparticle-basedadjuvantscanincreasetheefficiencyofgenetransfectionforaDNAvaccine.Here,webrieflyreviewtheresearchconceniingthecomponents,mechanisms,immuneadjuvanteffectsandclinicalapplicationsofnanoslructure-bas>edadjuvants.Keywords:Nanoparticle-basedadjuvant

5、s；Mechanism；Help-effect；Vaccine近年來，隨著基因工程技術(shù)和分子免疫學研究的不斷發(fā)展，多種新型疫苗相繼研發(fā)成功，如重組蛋白疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，為疫苗領(lǐng)域注入了新的活力，而與傳統(tǒng)的全菌疫苗相比，其免疫原性較弱，不足以刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應答，通常需要使用適當?shù)淖魟﹣碓鰪娖涿庖咴裕赃_到理想的免疫效果。傳統(tǒng)鋁佐劑是一種將抗原吸附于內(nèi)部,使其成為一個巨大的“抗原儲存庫”，通過局部注射進入人體后，充分發(fā)揮抗原緩釋作用,輔助抗原誘導產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應。鋁鹽佐劑是首先被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批準基金項

6、目：國家fl然科學基金(81172890)作者簡介:侯永利(I993-),女，鎮(zhèn)土研究生，主要從事H群流腦疫苗研究工作。通信作者：胡四海.教授.E-mail：hhsshh一518用于人類的疫苗佐劑。近20年來,多種新型佐劑被發(fā)現(xiàn)用于疫苗研究，它們在增強體液免疫和細胞免疫應答等方面與鋁佐劑相當或更加有效6】，其中，納米技術(shù)在佐劑中的應用為疫苗研究提供了更多的新思路。納米技術(shù)的概念由美國物理學家RICHARDFEYNMAN在1959年首次提出，意味著在分子水平上對單個原子進行修飾與調(diào)整。納米佐劑是指粒徑在1000nm以內(nèi)，可以增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型的納米粒子。現(xiàn)從納米佐劑的特性

7、以及無機納米佐劑，生物分子納米佐劑，新型納米佐劑的蛆成成分、作用機制、免疫輔佐效果、局限性以及臨床應用等方面對兒種目前具有較大發(fā)展?jié)摿Φ募{米佐劑作概述。1納米佐劑的特性納米佐劑具有提高疫苗抗原穩(wěn)定性、免疫原性以及緩釋性的特點，同時納米佐劑表面豐富的活化中心可以使其與抗原穩(wěn)定結(jié)合，作為高效的運載工具將抗原進行靶向運輸。納米佐劑可以通過封裝包賽、被動吸收或基因融合等方式裝載抗原，從而為抗原形成一個“倉庫”以防止酶解或水解，將抗原以完整的形式運送到淋巴細胞或者抗原提呈細胞(antigenpresentingcell,APC),促進抗原的提呈以及產(chǎn)生持久且高效的記憶性免疫應答。與此同時，一些納米佐劑還

8、具有免疫刺激作用，可以通過提高APC的提呈效率從而增強免疫應答。研究發(fā)現(xiàn),粒徑是影響疫苗在體內(nèi)運輸和被APC攝取的重要因素。粒徑1000nm的納米粒子容易被樹突細胞和巨噬細胞攝取，而粒徑100nm的粒子則更容易通過淋巴管輸送而與APC接觸。實驗證實,納米佐劑能夠誘導較強的體液免疫和細胞免疫，并且能夠延緩抗原的釋放速度，從而持續(xù)刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體。因此，納米佐劑越來越受到疫苗研究者的青睞。2無機納米佐劑納米磷酸鈣佐劑納米磷酸鈣佐劑(calciumphosphatenanoparticles)是通過共沉淀以及反向微乳液的方法制備而成的粒徑1000nm的納米顆粒，具有良好的生物相容性及安全性，

9、nJ以作為一種有效的運載工具將外源基因轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)進行抗原識別。19世紀，磷酸鈣納米顆粒由RELYVELD教授在法國巴斯德研究所首次研制。將納米磷酸鈣包裹皰疹病毒蛋白后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其可刺激小鼠產(chǎn)生較高的抗原特異性細胞免疫和體液免疫應答，同時未見明顯的不良反應，對小鼠有較理想的保護作用。目前，多家公司研發(fā)了納米磷酸鈣佐劑，有些已實現(xiàn)了商品化。其中美國BioSante制藥公司對其生產(chǎn)的納米磷酸鈣佐劑Biovant©做fI期臨床試驗，旨在確定Biovant®是否能提高機體對H5N1禽流感病毒抗原的免疫效應。KIVERA等研究發(fā)現(xiàn),Biovant©能刺激機體產(chǎn)生高滴度的

10、抗H5N1特異性抗體，效果與相佐劑相當，且無明顯的安全性問題。與此同時,PEDRAZA等研究表明，合成粒徑約為700nm的磷酸鈣納米顆粒，通過細胞毒性試驗評價其安全性，并利用熒光顯微鏡和流式細胞儀對其基因轉(zhuǎn)染能力進行評價，結(jié)果表明該磷酸鈣納米顆粒可顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率，提示納米磷酸鈣佐劑具有成為DNA疫苗載體或佐劑的潛能。目前，多種以納米磷酸鈣作為佐劑的疫苗正在研制之中，包括HBV、HSV-2、流感疫苗等n”。但是采用磷酸鈣納米顆粒進行基因轉(zhuǎn)染時，有可能會導致外源基因整合入宿主基因組從而降低疫苗安全性。2.1 納米鋁佐劑納米氫氧化鋁佐劑(aluminumhydroxidenanoparticl

11、es)是由較小的纖維粒了聚集而成的大小約為4.5nmx2.2nmx10nm的顆粒，它是在傳統(tǒng)鋁佐劑的基礎上進行分子改構(gòu)后形成的納米佐劑。鋁佐劑是FDA首先批準使用的人用疫苗佐劑,但其作用主要是增強體液免疫應答，對細胞免疫的輔助效果不明顯，只適用于作為具有強免疫原性或可大量生產(chǎn)的疫苗抗原佐劑'。目前,多家研究機構(gòu)正在積極研發(fā)納米鋁佐劑，并已取得可喜的成績。SUN等:通過水熱合成的方法制成納米鋁佐劑，粒徑約為100nm,并進一步控制反應條件獲得了不同形貌的納米鋁顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，將納米鋁佐劑制備成棒狀結(jié)構(gòu)，能更好發(fā)揮納米鋁的佐劑效應，這為納米鋁佐劑在物理性狀上的研究奠定了良好基礎。LI等用含

12、納米鋁佐劑與常規(guī)鋁佐劑的疫苗分別免疫小鼠,40d后取小鼠注射部位組織進行觀察。結(jié)果顯示，與常規(guī)鋁佐劑相比，納米鋁佐劑免疫小鼠的注射部位無明顯炎癥反應，說明納米鋁佐劑與常規(guī)鋁佐劑相比具有更好的安全性。將鋁佐劑納米化，可極大地增大佐劑表面積，從而增加抗原吸附率。更令人驚喜的是,SUN等研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)鋁佐劑相比，納米鋁佐劑免疫的小鼠腫瘤尺寸明顯減小,這表明納米鋁佐劑可以提高腫瘤細胞疫苗(tumorcellvaccinetTCV)的抗痛效果。但納米鋁佐劑有時可能在注射部位上會引起輕微的炎癥反應，這與其具有免疫刺激效應，可以通過活化炎癥小體來誘導產(chǎn)生IL-lg、IL-18等有關(guān)。3生物分子納米佐劑3.

13、1脂質(zhì)體脂質(zhì)體(liposomes)是由一層或多層雙分子膜包封而成的空心小泡結(jié)構(gòu)，兼具佐劑和載體功能。它可促進APC對抗原的攝入，從而增強免疫效應。1965年,BANGHAM等(郵首次發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體。研究人員合成了雙層間交聯(lián)的多層脂質(zhì)體載體結(jié)構(gòu)。利用該載體包裹抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)后免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)其可顯著提高機體的體液免疫和細胞免疫水平，且血液中近30%的CD8T細胞發(fā)生了快速增殖。專門從事藥物傳遞系統(tǒng)開發(fā)的ALZA公司開發(fā)研制了長循環(huán)脂質(zhì)體，其粒徑約為150nm,該技術(shù)被成功應用于阿霉素脂質(zhì)體注射液Doxil©中。Doxil®于1995年在美國上市，

14、并已取得了治療乳腺癌、卵巢癌、骨翰瘤等多種臨床適應癥許可'閭。近年來，默克公司研制的BLP25脂質(zhì)體疫苗Stinwvax®受關(guān)注，其作用原理為激活人體免疫系統(tǒng)，使之靶向作用于表達腫瘤抗原MUC-1的腫瘤細胞。臨床II期研究顯示,Stimuvax©能產(chǎn)生較強的免疫攻擊效果，并旦在長期治療中耐受性良好,無劑量限制性毒性。遺憾的是，該疫苗在臨床III期研究中遭遇失敗，被迫停止研究【。該研究表明如果腫瘤疫苗沒有特異性的靶標，單靠佐劑產(chǎn)生的免疫攻擊作用，對于腫瘤治療來說是遠遠不撕的。利用脂質(zhì)體作為免疫佐劑具有其他佐劑無可比擬的優(yōu)勢:脂質(zhì)體作為載體具有與鋁佐劑相似的免疫效果;脂

15、質(zhì)體載體主要成分為脂類,易于被機體生物降解，能顯著降低注射部位出現(xiàn)炎癥反應的概率;脂質(zhì)體作為載體可包裹大量的抗原，具有極強的儲存庫效應然而，脂質(zhì)體作為佐劑仍有某些尚未解決的難題,如在包裹抗原過程中，小的脂質(zhì)體傾向于融合成大脂質(zhì)體以形成穩(wěn)定狀態(tài)，而在脂質(zhì)體相互融合過程中，易造成其內(nèi)包裹抗原的丟失，從而影響免疫效果】。總體來說，脂質(zhì)體作為載體為疫苗的發(fā)展提供了新的思路，但脂質(zhì)體佐劑的穩(wěn)定性仍是研究工作的-大瓶頸，其能否順利用于人類疫苗還需更深入的探索和研究。3.2 類病毒體類病毒體(virosomes)由圓形單層小囊構(gòu)成，是一種不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，直徑約為150mn。類病毒體抗原釋放系統(tǒng)是在脂

16、質(zhì)體的基礎上發(fā)展的一種更高級的抗原輸送系統(tǒng)。一般認為，類病毒體保留了天然病班顆粒的空間構(gòu)象和誘導中和抗體的抗原去位,不但能激發(fā)體液免疫，而旦還可以激發(fā)細胞免疫和黏膜免疫.在沒有任何佐劑的情況下仍可誘導較強的免疫應答。最具代表性的類病毒體疫苗為甲肝疫苗Epaxal©,2003年在尼加拉瓜進行的臨床試驗證明，單劑的Epaxal©能有效地控制甲肝的暴發(fā)和流行】。一項有6000多位受試者參加的臨床試驗顯示，分別接種Epaxal©和鋁佐劑疫苗后，受試者中出現(xiàn)注射部位疼痛的概率分別為24%和65%w。這說明與鋁佐劑相比，類病毒體疫苗具有更高的安全性。類病毒體佐劑可模擬自然感染

17、，誘導產(chǎn)生高水平的免疫應答;并且能夠在體內(nèi)完全生物降解，減少了外源性物質(zhì)在機體內(nèi)的殘留，故而更安全、高效。類病毒體屬于微生物，在敏感的宿主休內(nèi)可能會進行自我復制，引起宿主表現(xiàn)出一些感染的癥狀。因此,對類病毒進行基因修飾可以降低或者阻止其在宿主體內(nèi)的復制。3.3病毒樣顆粒病毒樣顆粒(virus-likeparticles)是由一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成的直徑在20200nin的空殼結(jié)構(gòu)。20200nm的病毒樣顆粒易通過直徑約為200nm的淋巴管擴散進入淋巴系統(tǒng)，與免疫細胞廣泛接觸。由于病毒樣顆粒不含核酸物質(zhì)，所以不具備感染性，且在體內(nèi)無法進行復制。病毒樣顆粒與天然的病毒結(jié)構(gòu)相似，大多數(shù)的病毒樣

18、顆粒具有二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)或螺旋結(jié)構(gòu)。由于其天然的病毒樣結(jié)構(gòu)，使得病毒樣顆粒易于結(jié)合在MHCI類分子和MHCII類分子表面，從而被APC所識別,刺激機體產(chǎn)生高水平的體液免疫以及細胞免疫應答。此外，病毒樣顆粒的多價性使得B細胞識別特異性抗原的受體可以有效的交聯(lián)以及活化2婦。通常來說，病毒樣顆粒的引流主要包括兩個步驟:首先，通過組織內(nèi)皮表面的空隙擴散進入淋巴系統(tǒng);其次，被動轉(zhuǎn)運進入淋巴結(jié)中的淋巴成纖維細胞2病毒樣顆粒作為疫苗運載平臺可以通過化學或者基因融合的方法將外源基因展示在其表面,成為嵌合病毒樣顆粒;該顆粒由于其結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，在沒有任何佐劑的作用下可以誘導強烈的免疫應答。RIEDL等商研究發(fā)現(xiàn)

19、，將乙肝核心蛋白通過微蠟RNA結(jié)合在病毒樣顆粒C端富含精氨酸區(qū)域;制備出乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒，將其刺激未經(jīng)免疫的小鼠脾細胞以及樹突細胞時，可誘發(fā)產(chǎn)生Thl型免疫反應，可以分別產(chǎn)生高水平的IFN-y及IL-12p70,來刺激活化T細胞的增殖以及誘導細胞毒性T細胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)和自然殺傷細胞(naturalkillercell,NK)的細胞毒性。KAWANO等S利用嵌合SV40病毒樣顆粒免疫經(jīng)HLA-A02：0】轉(zhuǎn)染后的小鼠,SV40病毒樣顆粒在體外通過上調(diào)成熟標志物CD80、CD40和CD86來促進樹突細胞的成熟、分化，因而可以在沒有佐劑的情況下，有效地

20、誘導產(chǎn)生特異性細胞毒性反應及保護性免疫對抗流感A病毒。Y1N等叫研究發(fā)現(xiàn)，在以乙肝病毒核心蛋由為載體制備新型炭疽表位疫苗的動物免疫試驗中，以病毒樣顆粒為載體的嵌合蛋白免疫組(不加鋁佐劑)誘導的抗體效價，與疫苗蛋白添加鋁佐劑組一樣高。病毒樣顆粒由于其自身的大小以及結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，可以作為一種高效且安全的疫苗遞送系統(tǒng)，同時其本身也有佐劑效應，可以輔佐外源性抗原產(chǎn)生更有效的免疫應答。然而，病毒樣顆粒的局限性在于其本身要裝載的外源基因的序列長度，外源基因所含氨基酸數(shù)量超過300時則會影響病毒樣顆粒自組裝成顆粒樣結(jié)構(gòu)，這就導致病毒樣顆粒的表面效應的缺失以及相關(guān)免疫刺激效應減弱。所以，提高病毒樣顆粒裝載外源基因

21、的效率是其成為通用高效的疫苗載體的必備條件。4新型納米佐劑4.1免疫刺激復合物免疫刺激復合物(immunostimulatingcomplexes,ISCOMs)是一種將抗原、膽固醇及植物皂昔QuilA以1：1：1的比例混合形成的復合型佐劑,是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，具有佐劑和抗原的雙重功能1984年，MOREIN等*出首次報道了ISCOMs的佐劑功能，并預言其有可能成為亞單位疫苗的佐劑，這一發(fā)現(xiàn)在疫苗研究領(lǐng)域引起了高度的重視。在ISCOMs基質(zhì)中，植物皂昔QuilA與固醇類或磷脂酰膽堿結(jié)合,形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，直徑約為40nmo臨床試驗結(jié)果顯示.ISCOMs可以在免疫機體后迅速有效地誘導T細

22、胞應答，尤其是Thl細胞應答，具有較高的免疫活性；同時，其可增強APC對抗原的遞呈，并具有刺激天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IL-12的能力如迂。近年來jsCOMs逐漸被應用于HIV、HSV、HCV和癌癥疫苗的臨床試驗之中，均獲得了良好的免疫效果建】。誘導黏膜免疫應答是預防經(jīng)黏膜途徑感染病原體的有效措施。霍亂腸毒素B亞單位和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位是目前已知最好的能夠黏膜用藥的非復制性黏膜佐劑，但這兩種黏膜佐劑因具有較大的毒性而應用受限。研究顯示，含ISCOMs的疫苗可通過口服或鼻腔接種的方式進行免疫，可在局部和全身黏膜表面誘導產(chǎn)生特異、有效的黏膜免疫應答M。表明ISCOMs是一種有效且安全的黏膜免疫佐

23、劑，可能會為黏膜疫苗的發(fā)展帶來希望。20世紀末,ISCOMs被進-步制備成QS-21佐劑來制備口蹄疫疫苗，該佐劑極大提高了疫苗的安全性需要指出的是，ISCOMs并不能與所有的目的抗原形成免疫復合物，它只能與含有較多疏水基團的免疫原結(jié)合，而含較多親水基團的免疫原并不適合與ISCOMs混合制備疫苗°MF59MF59是一種水包油型乳劑，由鯊烯(4.3%)、Tween80(0.5%)和山梨糖醇三油酸酯Span85(0.5%)在高壓條件下微流化而成，其平均粒徑v250nmoLOFANO等或研究表明,MF59能在注射部位形成局部免疫微環(huán)境，激活小鼠局部免疫細胞。同時，MF59可特異性誘導單核細胞

24、分化為成熟的樹突細胞，從而高效地攝取、遞呈抗原。前期臨床研究顯示，以MF59作為佐劑可以大幅度減少抗原的使用劑量，并且在免疫機體之后誘導產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫應答】。臨床毒理學研究表明，MF59無遺傳毒性、致畸或致敏等與治療相關(guān)的安全性問題，只有極少數(shù)志愿者出現(xiàn)了局限在注射部位的炎癥反應5)。1992年，由Novartis公司研發(fā),以MF59作為佐劑的季節(jié)性流感疫苗FLUAD©進行的臨床前試驗顯示，其免疫效果顯著39101997年，該疫苗在意大利獲得使用批準。之后的20多年，在美國和多個國家進行的多中心臨床試驗評估了Flu-ad©的免疫原性和安全性，顯示該疫苗能誘導較高的抗體水

25、平，同時沒有檢疣出與MF59佐劑相關(guān)的安全性問題°2014年，以MF59為佐劑的流感疫苗FLUAD©獲得FDA使用批準正式上市叫。5展望目前,疫苗是對抗及預防疾病的有效手段，對于不同的病原體則需要新型且可以有效誘導機體產(chǎn)生適應性免疫的措施，而納米技術(shù)的引入開創(chuàng)了疫苗研發(fā)的新思路。納米佐劑作為抗原運載工具以及免疫刺激物.將疫苗抗原通過不同途徑在體內(nèi)誘導適應性免疫和固有免疫，從而提高疫苗的免疫保護性】，旦已應用于多種疫苗研發(fā)中，在多種動物模型實驗中表現(xiàn)出安全性、緩釋性和高效免疫輔佐性等諸多優(yōu)勢。與此同時，納米佐劑具有合適的形狀以及大小，使其更為容易地進入引流淋巴結(jié)，從而有效地被

26、APC識別并提呈誘導特異性免疫反應-如。此外，由于疏水性的納米佐劑比親水性的納米佐劑可以誘導更加高效的免疫反應，因此，可以通過物理以及化學方法來優(yōu)化親水性納米佐劑結(jié)構(gòu),從而提高抗原裝載率使其更好的發(fā)揮佐劑效應。隨著疫苗學的進一步發(fā)展以及針對納米佐劑作用機制的深入研究，將會有更多的納米佐劑被發(fā)現(xiàn)并用于人類和動物疫苗之中。參考文獻MATHAESR,WINTERG,SJAHAANTJ,elal.Influenceofparticlesize,anelongatedparticlegeometry,andadjuvantsondendriticcellactivationfJ.EurJPham)Bio

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