1、用射線照射的B7-1轉基因細胞進行腫瘤疫苗的研究劉巖王曉民徐萬?！菊磕康奶接懹梅派涞腂71轉基因細胞進行腫瘤疫苗療法的效果。方法將重組人B7-1基因其核表達載體導入QXK-1腎細胞瘤細胞，利用轉基因細胞治療觀察其抗腫瘤效果。結果轉基因細胞的腫瘤原性較CAKl/Wt、CAK-l/pCDNA3組明顯降低(PV0.001)。同時免疫原性明顯增強，以Co照射的CAK-1/I571細胞免疫后.小鼠體內誘發了抗CAK-1/Wt的系統性、保護性免疫。用“'Cq滅活的轉基因細胞作為痛苗進行實騷性治療.能夠延K小鼠的生存時間，減慢腫瘤的生K速度XAK-1/B7-1的應用提高了腫瘤治療效果(PV0.0

2、1)。結論放射的轉基因細胞及其表達的R7細胞因了可以有效地激發機體的抗腫瘤免疫應答.B71表達腫瘤細胞應用可以成為一種很有前景的腫瘤疫苗。關鍵詞B7-1癌疫苗基因治療中圖分類號R394.21文獻標識碼AStudyofCancerVaccinewithIrradiatedB7-1TransgenicCellsLIUYan,WANGXiao-min.XUWan-hai»etal.DepartmentofUrology«TheFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity.HarbinHeilongjiang.ChinaAbst

3、ractObjectiveToinvestigatethesynergisticallyeffectofirradiatedB7Ttransfcclantcellsascancervaccine.MethodsTheeukaryoticexpressionvectorencodingB7-1genewastransfectedintoCAK-1renalcellcarcinomacells.Thecellswereusedtotreatthemiceandthethera|>euticeffectswereassessed.ResultsIncontrasttothemiceinCAK1

4、/WtorC'AK-l/pCDNA3groups*thetumorigenicityofCAK-l/B-7transfectantdecreased(P<0.()()1).Immunizationofmicewith“CoirradiateCAK-1/B7-1tumorcellsshowedsignificantsystematicprotectiveeffectsagainstthesequencerc-challengeofCAK-1/Wt.Vaccinationwith">CoirradiatedCAK1/B-7cellsdelayedtheoccurren

5、ceoftumorandprolongedthesurvivalperiodofmicewithtumor.ThevaccineofCAK-I/B71inducedanenhancedtherapeuticeffect(PVO.()1).ConclusionIrradiatedtransgeniccellscouldenhancetheantitumorimmunityofthehost.VaccinesofCAK1/B7-1canimproveimmunityofhostandarepromisingcancervaccines.【Keywordsj137-1；Cancervaccine；G

6、enetherapy目前對腎腫瘤的免疫治療有使用里組白細胞介素-2或白細胞介素2與干擾素-a同時使用，以及輸入經體外擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞或日體瘤細胞疫苗的方法，但療效都不甚理想，其主要原因在于腫瘤抗原進入體內后不能被有效地提呈。腫瘤疫苗與傳統疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預防，而是通過瘤苗的接種刺激機體對腫瘤的免疫應答來治療腫瘤。由于人腫瘤相關抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激機體的免疫應答，因此單純用自身或同種腫瘤細胞作瘤苗治療腫瘤的效果不好。B7因子主要存在于活化的B細胞和抗原遞呈細胞表面。在通常性況下，腫瘤細胞合成的胞內抗原經胞內降解、處理后,形成的腫瘤肽抗原與MHC1類分子

7、結合后，共表達于痛細胞表面。其表面的肽抗原-MHCI類分子復合物被TC細胞識別，同時其表面B7因子也與TC細胞的CD28分子結合，這樣TC細胞就可被活化，從而殺傷帶有該肽抗原的腫瘤細胞。大多數腫瘤細胞由于沒有B7因子，因此腫瘤細胞雖具有肽抗原與MHCI類分子的匆合物，但由于不能提供第二信號，所以不能活化TC細胞本研究旨在利用B7基因轉染腎腫瘤細胞.使之表達膜B7因子，形成瘤苗，接種到體內后直接活化TC細胞，誘導其殺傷腎臟腫瘤，從而為腎臟腫瘤的臨床治療提供新的方法和思路。1材料與方法1.1主要試劑Lipofectamine200()轉染試劑購自Invitrogen公司；RPM11640、DMEM

8、培養液、胎牛血清和G418均收精日期：2008-11-21基金項目：黑龍江省衛生廳科學技術項目(2006-234)作者單位：哈爾濱醫科大學第四臨床醫學院泌尿外科(哈爾濱購自Gibco公司。含人B7-1cDNA完整開放閱讀框架的真核表達載體PCDNA3-B7-1由研究室自行構建。1.2細胞株和實驗動物CAK-1腎癌細胞系從美國ATCC獲得，本室常規培養。C57BL/6小鼠購自中國醫學科學院.雌性,68周齡。1.3 方法1.3.1CAK-1細胞轉染與克隆取對數生長期的CAK-1腎癌細胞接種于6孔板，每孔5xW5個，待細胞融合率達到9()%時，分別加入用轉染試劑Li-pofenctamine20(X

9、)包被的pCDNA3-B-7重組載體和PCDNA3空載體，培養48h后.加G418(600Mg/ml)繼續篩選培養，12天后.分別挑去抗藥克隆，用RT-PCR和Westernblot檢測B7-1表達的表達情況.得到轉B7-1基因和陰性對照的CAK-1腎癌細胞系。1.3.2細胞的放射處理上述轉基因細胞依實驗要求用6孔培養板培養.實驗前8h用Co進行亞致死量照射(5000Rad),經檢測，此時細胞的存活率>95%,具有正常表達及分泌能力。1.3.3 小鼠成瘤試驗分別取非照射的1x107CAK-l/WuCAK-l/pCDNA3XAK-l/B7-1細胞接種C57BL/6小鼠背部皮下，每隔2天觀察

10、并記錄結節形成時間、生長速度及存活時間。每組5只，結節大小以長徑X短徑計算。1.3.4轉基因細胞的免疫保護試驗小鼠隨機分組分別注射經SC。照射的CAK1/Wt、CAK-1/pCD-NA3.CAK-1/B7-1細胞5X1()1()天后皮下接種非照射的CAK-1/Wt細胞,觀察腫瘤結節的生長情況及小鼠的存活時間。1.3.5轉基因細胞的試驗性治療以非照射的CAK-1/Wt細胞1X10$皮下接種C57BL/6小鼠，接種后第3、6、9天以的Co照射的2.5x伸CAK-1/Wt細胞分別和2.5X10'各種轉基因細胞1：1混合，再接種對側皮下,觀察腫瘤結節的生長情況及小鼠的存活期。1.3.6統計分析

11、實驗數據以均數土標準差(x±5)表示，采用SPSS10.0統計軟件包進行統計學處理.組間比較采用t檢驗,PV0.05為具有顯著性差異。2結果2.1轉基因細胞株的建立對轉染后的CAK-1細胞進行RT-PCR和Westernblot分析顯示，與pCDNA3空載體轉染對照細胞相比，pCDNA3-B7載體轉染的CAK-1細胞中B7基因無論是mRNA水平還是蛋白水平均有明顯升高(圖1：A.RT-PCR檢測B7基因轉錄本的水平；B.Westernblot檢測B7蛋白的表達情況)。ABpCDNA3pCDNA-B-7pCDNA3pCDNA-B-7圖1PCDNA3-B7載體轉染CAK-1細胞后B7基因

12、的袤達檢測Figure1ExpressionpatternofB-7geneaftertransfectingpCDNA3B-7vectorintoCAK-1cells2.2轉基因細胞的腫瘤原性用1x偵個非照射的轉基因細胞CAK-1/B7-1與CAK-1/Wt、CAK-1/pCDNA3腫瘤細胞接種小鼠皮F，CAK-1/B7-1與CAK-1/Wt.CAK-1/pCDNA3細胞在小鼠體內的生長狀況及存活期明顯不同腫瘤結節的檢出時間、生長速度及存活期差異無顯著性。而CAK-1/B7-1細胞組腫瘤的形成時間明顯推遲，生長速度明顯減慢，存活期也顯著延長，見表1。>1CAK-1/B7-1轉基因痛苗的

13、致瘤效應明顯減弱(x±5)Table1ReducedtumorigenesiscapacityofCAK-1/B71transfcctants(t±s)細胞出瘤鼠/總鼠數(只)成痛率成瘤時間平均存活平均瘤2周3周4周6周()(d)時間(d)體積(cn?CAK-1/Wt(：AK-l/pCDNA3CAK-1ZB7-13/53/55/5-10018.6±4.232.4±5.28.4±2.72/53/55/5-KX)19.3±5.730.0±2.39.1±1.«0/52/52/53/5.40*28.5±

14、1.8"42.0土().0.3.5±U.6,注:CAK-1/B71與其它兩組比校，PV0.012.3轉基因細胞的免疫保護作用的CAK-1/Wt和CAK-l/pCDNA3細胞未能誘導有用5XIO。個®Co照射處理的CAK1/B7-1與效的保護性免疫。在14天左右可檢出腫瘤結節，存活CAK-1/Wt、CAK-l/pCDNA3腫瘤細胞作為瘤苗分別期約45天。而經CAK1/B7-1細胞免疫后的小鼠腫免疫C57BL/6小鼠，10天后接種非照射的CAK-1/瘤生長明顯抑制，觀察期結束時仍有3只小鼠未檢出Wt腫瘤細胞,觀察免疫保護作用。結果表明&>Co滅活結節，生

15、存時間顯著延長(,PV0.(X)1,見表2)。結果提示轉基因細胞的免疫原性顯著增強，并能誘導機體產生有效的抗腫瘤效應。表2CAK-1/B7-1轉基因痼苗對野生型CAK-1細胞可誘導免疫保護效應Table2AntitumorimmunityprotectioninducedbyCAK1/B7-1againstthechallengewithwildtypeofCAK-1細胞出瘤鼠/總鼠數(只)2周3周4周6周CAK-1/Wt2/54/55/5-CAK-1/pCDNA32/54/55/5-CAK-1/B711/51/5-2/5*2/5,注:CAK-1/H7-1組與其它兩組比較，PV0.0012.4

16、轉基因細胞的試驗性免疫治療用非照射的CAK-1/Wt腫瘤細胞IX1(),預先接種C57BL/6小鼠，在3、6、9天用"Co照射的2.5xW5CAK-1/Wt細胞分別和2.5xIO'各種轉基因細胞1：1混合，接種于對側皮下,觀察腫瘤生長情況。在治療實驗中，接種了CAK-1/B7-1轉基因細胞的小鼠腫瘤生長較對照組明顯減慢，此治療可明顯推遲腫瘤結節檢出時間，延緩腫瘤的生長速度，并有效地延長了荷瘤宿主的存活時間(,PV0.01),見表3。表3射線照射的轉基因痼苗對野生型CAK-1細胞致痛的治療作用G±5)Table3TherapeuticeffectonCAK-1/Wtt

17、umorwithirradiatedtransfectantstreatment(x±s)細胞出痛鼠，總吸數(只)成痛時間平均存活平均痛休2周3周4周6周(d)時間(d)積(cm5)CAK-1/pCDNA3CAK-1/B7-12/53/50/51/55/5-3/53/514.315.731.0+3.525.311.6-45.0±0.0*11.2±2.63.6±1.4-注:組間比較，PV().()13討論大量的研究表明，將某些細胞因子基因轉入腫瘤細胞制成新型的腫瘤疫苗，可以有效的激發機體有效的抗腫瘤免疫功能，此種方法已成為腫瘤基因治療的研究熱點。本研究應用

18、B7-1轉基因修飾的CAK-1腫瘤細胞既能表達活化因子B7,同時又具有所有的腫瘤細胞抗原,可激發抗腫瘤免疫。雖然其體內的成瘤性降低，但是直接用此種細胞進行治療的危險性仍然較大(表1)。作者將細胞經"Co照射后，進行了免疫保護試驗和治療性實驗，觀察到明顯的抑瘤效果。眾多實驗表明，細胞因子基因在腫瘤局部的持續表達可以有效地改變腫瘤細胞的免疫微環境,增強腫痛細胞特異性的抗原提呈，活化CTL細胞，從而產生抗腫瘤免疫。本次實驗結果表明經B7基因修飾后的CAK-1細胞致瘤原性有很大程度的降低.腫瘤生長潛伏期及荷瘤生存期明顯延長。在基因轉導細胞作為痛苗用于小鼠免疫接種的實驗中，結果發現明顯的抑瘤效

19、果，荷瘤小鼠無論是成瘤時間，還是存活時間，都比對照組有顯著的延長，腫瘤體積也明顯減小,說明經過射線照射和基因修飾的腫瘤疫苗能夠有效并且相對安全的誘導抗腫瘤免疫。當然，作者在實驗過程中也發現B7轉基因細胞不能完全消除腫瘤細胞的致瘤性，說明依賴于單一活化因子具有一定的局限性，并不能提供完全的抗原遞呈及活化效應，聯合不同的細胞因子，產生協同作用有可能很好的解決這個問題。如IL-2和IL-6等細胞因子,它們均可激活T細胞，誘導NK、LAK、CTL細胞活性，此外JL-2nf以改變T細胞的異常信號傳導，而IL-6可以增強細胞MHC抗原的表達旭刃。因此由這些細胞因子基因修飾的腫瘤細胞可以從多種機制獲得更好的抗原遞呈及免疫刺激效果。顯然在腫瘤疫苗應用中，如何更好地促進腫瘤抗原的遞呈,加強生物安全性，仍是腫瘤生物治療研究中一個難題。參考文獻1 BrunoS.TcncaC,SaverinoI),etal.Apopiosisofsquamouscellsatdifferentstagesofcarcinogenesisfollowing4HPRtrcatmcntJ.Carcinogenesis,2(X)2,23(3)：447-456HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofc