1、主題策劃FEATURE豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究王鳳，湯德元李春燕.王彬，張曉杰，甘振磊.劉志杰(貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025)摘要:豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種急性腸道傳染病。該病由豬流行性腹瀉病毒感染豬而引起.以發熱、厭食、水樣腹瀉、嘔吐、嚴重脫水、消化道黏膜發炎及糜爛和食欲下降為主要特征，俗稱冬季拉稀病該病已成為世界流行性的疾病，是各養豬國家導致仔豬早期死亡的重要疫病之一，給養豬業造成嚴重的經濟損失。近幾年來,隨著分子生物學的發展，人們對豬流行性腹瀉病毒的基因結構、基因功能.分子致病機理.檢測手段以及疫苗預防方法有了更深入的認識。而對豬流行性腹瀉的預

2、防和控制以接種疫苗為主，筆者主要針對豬流行性腹瀉病毒基因結構、功能以及疫苗等方面的研究進展進行綜述，為豬流行性腹瀉病毒基因的深入研究和預防提供一些參考。關鍵詞:豬流行性腹瀉:病毒基因;結構及功能;疫苗研究資助項目：貴州省貴陽市2005年畜牧科技專項基金項日資助【編號：(2005)筑科農字第4-11號;作者簡介：王鳳(1985-),女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子病毒學的科研學習.,通訊作者：湯德元(1964-),男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫結合的教學科研工作.豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarr

3、heavirus,PEDV)引起豬的種急性腸道傳染病。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病荏科(coronaviridae)冠狀病曜屬(coronavirus)的成員.主要引起豬流行性腹瀉。各種年齡、各個品種豬均可感染發病，哺乳仔豬、架子豬、育肥豬的發病率可達100%,成年母豬發病率為15%90%.其發病特點是：日齡小，癥狀重，日齡大，癥狀輕。1周齡哺乳仔豬常在腹瀉34d后脫水死亡，病死率達50%.斷奶豬、育肥豬癥狀較輕，腹瀉可持續47d,成年豬僅發生嘔吐和厭食.PEDV與豬傳染性肖腸炎病毒(TGEV)同屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，2種病毒感染后所引起發病豬的臨床癥狀、流行特點和病理變化都極其相

4、似，均給罪豬業帶來嚴收危害。當前PED發生率居高不下，發病情況也越來越復雜，出現混合感染的現象時有發生，目前倍受廣大研究者的取視.本文主要針對PEDV的基因組結構、功能和PED疫苗的研究進展進行了綜述，為豬流行性腹瀉基因的深入研究及對PED的預防提供參考。1PEDV的基因結構及功能PEDV基因組是單股正鏈具有感染性的RNA,與其他冠狀病毒相似，其基因組5端有一個帽子結構(cap),3端有一個Poly(A)尾，基因組全長為28033nt(PEDVCV777毒株)。基因組5,端非翻譯區(5UTR)位于復制酶多聚蛋白基因上游，長296nt,5UTR內含有長為6598nt的前導序列(L)和一個AUG為

5、起始密碼子井擁有Kozak序列(GUUCaugC)和編碼12個氛基酸的開放閱讀框架(ORE).目前，除人冠狀病毒HCV229E外，已知的其他冠狀病毒成員都有Kozak序列，但序列有所差異.基因組3端非翻譯區(3UTR)長度為334nt,末端連有Poly(A)序列，3UTR內含有由8個堿基(GGAAGAGC)組成的保守序列，起始于poly(A)游的73nt處，所有冠狀病毒成員都包含這個序列，只是在基因組中位置不同。刺余PolSORF3sMMN圖1PEDV基因組結構基因組序列包括6個ORFs（見圖1）,從5，一3,端依次為編碼復制酶多聚蛋白lab（pplab）.纖突蛋白（S）,ORF3蛋白、小膜蛋

6、白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）的基因。復制酶多聚蛋白基因占全基因組2/3,長20346nt.包括ORFIa（12354nt）和ORFIb（8037nt）2個開放閱讀框架，二者之間有46nt的重疊序列，更登處有滑動序列（UUUAAAC）和假結節結構，它們能使核糖體進行移碼閱讀（frameshifting）從而保證基因1的正確翻譯。S基因、E基因、M基因和N基因分別編碼病毒的結構蛋白，長度分別為4152nt.231nt、681nt、1326nt.ORF3基因長675nt,編碼非結構蛋白，在每兩個相鄰基因之間有基因間隔序列（intervalsequence,IS）,它與基因組和亞基因組m

7、RNA的L序列3端有7-18nt相同，在病毒基因組發制和翻譯過程中發揮重要作用。1.1Pol基因Pol基因編碼依賴于RNA的非結構蛋白，即夏制酶多聚蛋白lab（pplab）,為RNA多聚酶。復制酶多聚蛋白分子質量約為753ku,有13個預測蛋白酶切割位點。PEDV基因組中S基因上游除編碼多聚酶的基因外并無其它基因。這同缺乏PEDV相關的血細胞聯集陶活性結果一致。因為，如果冠狀病毒基因組存在這樣一種基因，它必定總是存在FS和多聚酶基因之間。多聚酶基因由2個大的重睿的開放性閩讀框架ORFIa（12354nt）和ORFlb（8037nt）組成，其中ORFIa和ORFIb共有46個核吾酸的重疊，重疊區

8、有一特異性7核普酸序列（UUUAAAC）和一假結節結構。多聚酶基因翻譯成2個多蛋白前體，即ppla和pplab,較大的蛋白pplab則是通過核糖體移碼機制合成，并需要特異性7核昔酸序列和假結節結構。ORFIa主要編碼蛋臼水解酶，包括分別切割復制酶多聚蛋白N端和C端的類木瓜蛋白酶（PL-PRO）和類脊費灰質炎病毒3C蛋白海（3CL-PRO）。PL-PRO的切割活性對鋅R有強依賴性。3CLPRO識別底物的核心序列是（ILMF）-QH（SAGC）。另外，ORFIa編碼蛋白還含有3個轉膜域（TM）ORFIb主要編碼RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）,同時有3個蛋白結構域分別是鋅指蛋白域（Z）也稱金屬

9、結合域、螺旋酶域（Hcl）和保守序列域（C）.復制酶多聚蛋白經共轉譯處理后產生與病毒基因組安制相關的一系列蛋白質，主要功能包括負鏈RNA,前導RNA,sgmRNA（亞基因組RNA）和子代病RNA的轉錄作用以及對多聚蛋白切割產生具有功能產物的蛋白酶切割作用。因此，在病毒感染早期發揮重要作用。1.2 S（Spike）基因PEDVS基因的啟動密碼子通常并不是用于啟動蛋白質的合成，而是翻譯分子量為180220ku的1383個氨基酸的多肽，即S蛋白，該多肽含有29個潛在的N-連接的糖基化位點，是PEDV的1個重要的結構蛋白，是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，并有與其他冠狀病謹纖突蛋白相似的結構特點。序列同

10、一性比較表明，PEDVS基因與HCV229E（人冠狀病毒）的序列分別有60%（S2區）和37.0%（S1區）的同源性；與FIPV（貓傳染性腹膜炎病春）、TGEV、和CCV（犬冠狀病毒）的S序列分別有59.%60.0%（Sl區）和35.5%35.9%（S2區）的同源性。PEDV和HCV229E旁側序列在迄今所測定的所彳jS蛋白基因中都顯示了保守性。S蛋白在免疫反應中起1：要作用，在病毒感染宿主機體后介導中和抗體產生的過程中發揮重要生物學作用，如識別靶細胞、促進病毒和細胞膜融合的作用，故S蛋白被認為是發展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原。此外，S蛋白有2729個潛在的糖基化位點，在低滲非離子溶劑中溶解

11、度最大。當PH值為4時，S蛋白溶解度最大.而N蛋白則要求pH為9。制備的S蛋白和N蛋白可用作ELISA抗原，分別命名為S-EL1SA和N-ELISA。S-ELISA比N-ELISA更為有效.感染PEDV豬血清中的抗S蛋白抗體比抗N蛋白抗體更為持久，即可在更長的時間中檢測到抗S蛋白的抗體。1.3 0RF3基因ORF3基因能編碼ORF3蛋白。ORF3蛋白為223個氨基酸的多肽，分子質量為25.3ku,是一種非結構蛋白，其位置在116784個核其酸之間。ORF3基因編碼的產物存在一個含6個His的尾。ORF3基因至少存在3個可變區，有短的核甘酸缺失（27nt）對PEDV的2個不同分離株CV777和B

12、rl/87的測序后發現，這些核1T酸缺失2個分離株都有。ORF3序列中還發現了兩個功能基序（Motif）:精氨酸酶信號肽和ATP/GTP結合位點。由于ORF3基因中核昔酸映失的存在，所以不能通過細胞培養復制ORF3基因產物。對PEDVCV777和Brl/87兩個不同分離株的研究發現，雖然有時核節酸酸失是在相同的位置，但缺失并不總是相同。可以認為，CV777和Brl/87起源于相同的病毒群，但以后各自進化了。Park等（2007）對PEDVDRI3強、弱卷的ORF3序列進行了分析，發現致弱的DR13在0RF3有17個氨基酸的缺失，為強、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據。說明0RF3基因與病毒毒力

13、有關虬sM（sma11membrane）基因sM基因編碼E蛋白，E蛋白是PEDV最小的結構蛋白，由76個氛基酸組成，預測分子量為8.8ku,其散在分布于病毒囊膜上，在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關重要的作用。PEDV的sM基因序列與HCV229E和TGEV的相比，分別有54%和29%的同源性。PEDV2個病毒分離株CV777和Brl/87的sM基因嚴格保守。Northern雜交分析PEDV亞基因組RNA時發現，編碼sM多肽的mRNA同預測的RNA5（成熟的病毒粒子中的第5個RNA組分）電泳遷移率相同。目前，研究者將PEDV的sM基因和M基因導入甲病毒載體（pSFV）,在BHK-21細胞中得到

14、了成功的表達，為進一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎。1.5M（Membrane）基因M基因編碼M蚩白，M蛋白是一種穿膜蛋白，由226個氨基酸組成，分子量介于2732ku之間。對M基因的序列比較分析表明，PEDV與HCV229E和TGEV的同源性分別為57%和53%。CV777和Brl/87核昔酸序列比較分析表明，在M基因上僅有2個核皆酸的差異。M基因非常保守，PCR檢淵時PEDV的引物一般都是針對M基因而設計的。M蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，同時也是病毒刺激機體產生免疫保護的重要結構蛋白。另外，M蛋白能介導機體產生干擾素，所以M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗

15、的候選基因。因此獲得M基因在體外有效的蛋白表達產物，無論是對PEDV感染增殖的基礎性研究.還是利用M蛋白進行病原鑒定或疾病免疫預防，均具有重要的理論和實踐意義。現已用兔抗肽血清鑒定PEDVM$白，并用桿狀病毒進行了表達。活性的M蛋白為N-糖基化，分了域約為27ku,而重組體桿狀病毒合成的M蛋白（相對分子質最）Mr為23ku,H與未糖基化的M蛋白有著相同的電泳遷移率。1.6N（nucleocapsid）基因PEDVN基因編碼N蛋白。N蛋白是PEDV的主要結構蛋白之一，主要作用是形成核衣殼，相對分子量為大小為5558ku,由44】個氛基酸組成。對PEDVCV777和Brl/872個分離株N基因序列

16、分析發現僅有2個堿基的差異，用套式PCR擴增4個分離株PEDVN基因540nt的片段后發現，其核苻酸序列基本相同。N基因1323個核昔酸的序列表明，PEDV與其他冠狀病毒N基因序列有相當部分相同。但PEDVN基因明顯比HCV229E和TGEV大，其中有一段大約135nt的潛在插入存在，其可能位于N基因中央。PEDV與TGEV、HCV229E的N蛋白的明顯不同之處就是在PEDVN蛋白中央部分有一段接近40個疑基酸的特別殘基，其中富含天門冬酰胺，絲氨酸和精氨酸。N某因在氨基酸和核甘酸水平上與HCV229E有很大的同源性，其序列與MHV、IBV、HCV的同源性為12%-19%,與FIPV、CCV、P

17、RCV、TGEV、HCV229E的同源性較高，為32%37%。N步白氨基酸序列比較，PEDV和HCV229E有63個相同的殘基,而和TGEV有49個相同的殘基。PEDV、TGEV、HCV229E的N端序列的一致性比C端高。N基因處于PEDV基因組3端，N基因的3端和poly（A）尾之間有一個11個核皆酸的保守序列，這一序列是病毒復制過程中RNA負鏈合成的識別位點。N基因的5,端也存在一個類似于內部保守某因為7nt的序列。N基因還有一個336個核皆酸的ORF,編碼富含Leu的蛋白。適應細胞生長的PEDVN基因含有3個內部開放閱讀框（internalopenreadingframes,IORF）,

18、分別命名為IT（113個密碼子）,1-2（63個密碼子）和1-3（72個密碼子），3個IORF均絕對保守。而牛的冠狀病毒（BCV）IORF（208個密碼子）表達一個與膜有關的23Ku的蛋白，但其生物學作用仍有待測定。MHV（鼠肝炎病旄）的IORF（207個密碼子）編碼一結構蛋白，該蛋白與病毒復制無關。PEDV所有3個IORF的共同編碼作用與BCV或MHV大約相當。野生型PEDVCV777分離株3端整個N基因和非編譯區的1800個核昔酸序列分析表明，野生型PEDV同適應細胞生長的PEDV相似，N基因下游未發現其他基因。病危的細胞培養不會導致該基因組區任何核樣酸的變化，然而，適應細胞生長的PEDV

19、對新生仔豬的致病力是明顯減弱了，這證明了該段基因及其基因產物對PED病毒致弱無關。不同冠狀病毒N蛋白比較顯示：在PEDVN蛋白中央行相當長的親水區域。另外N蛋白除和基因組RNA纏繞形成核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）復合體外，還參與病毒的復制和轉錄。N蛋白等電點高，缺少糖基化和RNA結合位點，PEDV完整的N蛋白等電點為10.5,但C端50個殘基的等電點很低，僅為3.4,這是由于其C端殘基通常是帶負電荷或呈中性。病毒感染細胞中N蛋白較卡富，N蛋白能與病毒多聚酶作用，或許還有可能同細胞因子作用，從而改變宿主細胞的轉錄。N賀白有67個潛在的磷酸化位點,在pH9.0低滲非離子

20、溶劑中溶解度最大。N蛋白有3個相對保守的結構域,位于中間的是-個能與病毒RNA前導列結合的RNA結合域。此外，在對冠狀病毒一些成員N蛋白亞細胞定位的研究中表明N蛋白在細胞核（或核仁）中定位的特征，進而也闡明了N蛋白的一些功能，N蛋白作為一個調節蛋白起作用，能第F擾宿主細胞周期，參與細胞通信，N蛋白還可以抑制干擾素的產生，誘導細胞調亡。而對PEDVN蛋白亞細胞定位特征的研究還沒有報道。N蛋白在PEDV的結構蛋白中所占比例最大，在感染的細胞中能得到大最表達。豬在感染PEDV的早期，體內就能產生抗N蛋白的高水平抗體。又鑒于其冠狀病毒N蛋白保守性強，所以利用N盅白來建立PEDV分子生物學診斷技術具有很

21、好的應用前景,71.2PED疫苗的研究對PED的預防和控制應以接種疫苗為主，國內外的研究者在PED疫苗的研究方面已經做了大量的工作，但到目前為止還沒有研制出特別有效的疫苗可以控制PED疾病的發生。卜面僅就豬流行性腹瀉各類疫苗的研究應用現狀及前紋進行概述。2.1滅活疫苗滅活疫苗包括組織滅活疫苗和細胞滅活疫苗。由于組織滅活苗效果很好，目前應用最為廣泛。哈爾濱獸醫研究所、上海農科院牧醫所和江蘇農科院牧醫所等單位試生產。王明等閭用PED滬株研制氫氧化鋁滅活苗接種后海穴，以0.ImL/頭主動免疫3日齡仔豬，保護率為77.28%,以0.5mL/頭主動免疫接種322日齡豬，保護率為85%.以5mL/頭被動接

22、種妊娠母豬，其所產3日齡仔豬的保護率為97.06%。接種疫苗后14d開始產生免疫力，免疫期可達6個月.細胞滅活苗制備方便，應用也越來越廣泛。馬思奇等明1994）研制的氧氧化鋁細胞滅活疫苗的主動免疫試驗和被動免疫試驗的保護率分別為88.89%及90.7%,并研制了豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉病毒二聯富氧化鋁細胞滅活疫苗，滅活前毒價均為107.0-107.5TCID50/0.3mL,主動免疫保護率：TGE為100%、PED為92%,被動免疫保護率：TGE為87.9%、PED為82.4%,免疫期均為6個月。疫苗保存期1年，田間試驗保護率92%96.35%。2.2細胞弱毒苗由于滅活苗產生完全免疫力需要

23、2周時間，且劑最偏大，不利于緊急預防與降低疫苗費用，所以又研制了細胞弱毒苗。國外Park等聊將PEDV經Vero細胞致弱后的毒株DR13,通過口服和肌肉注射兩種途徑免疫晚期妊娠母豬，觀察所產仔豬的發病率。結果口服免疫組的發病率（13%）遠低于肌肉注射免疫組（60%）,口口服免疫組仔豬抗PEDV的SIgA含量明顯高于肌肉注射免疫組。研究表明，可應用PEDV細胞弱毒苗經口免疫晚期妊娠母豬，從而有效預防PEDV感染。Kweon等明用分離到的野毒株（命名為KPEDV-9），使之適應Vero細胞并連續傳代至93代，進行主動免疫試驗、被動免疫試驗以及安全性試驗，結果都證實可作為弱毒苗使用。適應Vero細胞

24、并連續傳代至93代的KPEDV9,接種妊娠母豬.ELISA檢測結果表明，伴豬免疫應答水平大幅度提高，且新生仔豬可抵抗PEDV野毒感染。國內佟有恩等用CV777株強毒株適應Vero細胞系，并在83代后適應了仔豬腎原代細胞。以104124代細胞適應毒制備5批疫苗，主動免疫試驗的總保護率為95.92%以106139代細胞適應毒制備的8批疫苗，主動免疫試驗的總保護率為96.2%.在與TGEV弱毒組合制備的二聯弱毒苗的初步田間試驗中取得良好效果。2.3乳酸桿菌疫苗乳酸桿常作為微生態制劑中的主要益生菌，廣泛應用于食品、飼料加工業。構建乳酸桿菌質粒栽體，表達在黏膜系統中增殖的病原微生物的保護性抗原基因，制備

25、綠色環保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態制削疫苗應用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途徑。因此，研制刺激腸道黏膜免疫系統的TGE和PED基因工程乳酸桿菌疫苗有重要意義。目前，有的實驗室正在開展乳酸桿菌表達TGEV,PEDV主要保護性抗原基因的研究。此研究擬從健康豬體內分離鑒定出乳酸桿菌，井進一步篩選出thyA基因缺陷型乳酸桿菌，構建含有TGEV或PEDV主要保護性抗原基因的以thyA基因為選擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達載體，轉化乳酸桿榮，制備基因工程乳酸桿菌疫苗。目前已筋選出2株thyA基因缺陷型乳酸桿曲，并已初步鑒定。TGEV、PEDV的S基因的克隆擴增工作亦已結束虬2.4轉

26、基因植物疫苗Yang等財（2003）將PEDV的S基因轉入煙草中，提取轉基因植物蛋白給小鼠注射，進行血清蝕斑減數中和測定，證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉基因植物可i秀導小鼠產生全身免疫和黏膜免疫。Yang等（2005）相繼應用農桿菌介導的蛋白轉入法將PEDV的S基因的主要抗原位點（命名為K-COE）和合成的PEDV中和抗原表位在煙草中表達，前者重組體蛋白占轉基因煙草葉片總可溶性植物蛋白含量的0.1%,后者含量則為2.1%。這些研究為研制PEDV口服轉基因植物疫苗提供了新的思路。口前，在以煙草花葉病毒為載體的無煙堿煙草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表達，用表達蛋白免疫接種后.對仔

27、豬具有良好的保護作用，為PEDV轉基因植物疫苗的研究奠定了基礎。一些研究者將PEDV的E基因和M基因導入甲病毒我體中，在BIIK-21細胞中得到了成功表達，這為進一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定r基礎。植物的多種優越性均可被用于研究轉基因疫苗，并ft已經取得了很大的進展。但仍有一些障礙必須克服，如蛋白在植物中的表達水平低、表達產物在植物中的愆定性差、轉基因口服疫苗在產生免疫反應之前在胃腸道內有時被消化等，科學家就這些問題進行了研究并正在加以解決。2.5核酸疫苗核酸疫苗又稱為基因疫苗、DNA疫苗，是20世紀90年代初從基因治療研究領域發展起來的一種全新疫苗，與傳統的弱毒或滅活疫苗相比，

28、DNA疫苗具有不散毒、不返強的優點。DNA疫苗還具有可以制成標記性疫苗，便于臨床診斷監測I疫苗性質穩定，便于儲存和運輸；應用范圍廣，不僅可用于傳染病和寄生蟲病的免疫預防，而旦還能夠用于腫瘤、自身免疫、過敏反應等疾病的治療等優點。另外，與亞單位疫苗相比，具有能長期激發機體體液和細胞免疫反應、制備工藝簡單和費用低廉（不用純化蛋白）的優點。雖然核酸疫苗兼具亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗的有效性，但核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產生抗菌素DNA抗體等危險性，其安全性還有待于進一步觀察。豬流行性腹瀉核酸疫苗的研究還處于起步階段，是今后研究的熱點之一。2.6多價聯合疫苗TGEV和PEDV均屬冠狀

29、病毒，致病機理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯苗亦是可行的。尤其在我國豬病毒性腹瀉廣泛流行，研制多聯苗更是十分必要的。2.6.1TGEV與PEDV二聯疫苗該系列產品包括豬傳染性胃肪炎（TGE）和豬流行性腹瀉（PED）二聯滅活苗、二聯活疫苗和弱毒二聯疫苗，二聯天活苗和二聯活疫苗是由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所的馬思奇、佟有恩共同主持完成的。該二聯疫苗的特點是：毒價高，后海穴接種（是對常規免疫途徑的突破），增強了免疫保護力，一次接種即可，省時、省力。經國內外聯機檢索查新證明，該二聯苗是國際領先研制成功的，并在技術上有原始創新。兩種疫苗可用于主動免疫保護不同年齡的豬只，但主要用于妊娠母豬的被動免疫

30、以保護仔豬。其中二聯滅活苗主動免疫保護率為96%,被動免疫保護率為85.1%,二聯活疫苗主動免疫保護率為97.7%,被動免疫保護率為98%。2種二聯疫苗的免疫期均為6個月，仔豬被動免疫期是哺乳期至斷奶后1周。二聯滅活疫苗在免疫后14d產生免疫力,二聯活疫苗免疫后7d產生堅強的保護。PED和TGE弱毒二聯疫苗是用豬流行性腹瀉弱毒疫苗株PEDV-G1P83和豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗株TGEV-AG1制成。用該弱毒二聯疫苗進行了保存期試驗、安全效力、免疫期試驗和區域試照。結果表明，試驗疫苗在-2or保存4個月，經4個月保存的疫苗免疫效力未見下降。4C保存48h對疫苗病毒的毒價沒有明顯影響。用該弱毒二聯

31、疫苗按程序免疫妊娠母豬，對妊娠毋豬安全，其仔豬獲得了良好的被動免疫。其對PEDV強毒、TGEV強毒和2種強毒混合攻擊的免疫效力分別達90.48%、93.75%和87.5%。用二聯弱毒疫苗免疫810日齡的哺乳仔豬證明安全，28日齡時（25日齡斷奶）分別用PEDV強毒.TGEV強毒和2種混合強毒攻擊，免疫效力分別為100%、99.9%和73.3%。結果表明，該弱毒二聯疫苗能夠安全地對妊娠母豬和哺乳仔豬進行免疫，免疫后能有效地保護初生仔豬、斷奶豬和肥育豬抵抗TGEV和PEDV強毒的攻擊。該弱毒：聯疫苗在區域試驗中能顯著降低豬病毒性腹瀉的發病率和死亡率。2.6.2PEDV、TGEV、RV三聯滅活苗上海

32、農科院畜牧獸醫研究所錢永清等明采用豬流行性腹瀉病哉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（RV）細胞培養物制備了三聯滅活疫苗。實驗室免疫結果表明，妊娠母豬和育肥豬免疫后15d達到較高的免疫水平，免疫有效期超過6個月，妊娠母豬所產仔豬可獲得高水平的被動免疫保護。試驗場應用結果表明，母豬保護率達98%,仔豬被動免疫保護率達93%。綜上所述，PEDV的基因組為不分節段的單股正鏈RNA。其中Pol基因在病毒感染早期發揮重要作用，S基因被認為是發展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原ORF3基因與病毒毒力有關，sM基因在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關重要的作用，M基因編碼的M蛋白可以作為PE

33、DV基因工程疫苗的候選抗原，又鑒于冠狀病毒N蛋白保守性強，所以利用N基因編碼的N蛋白來建立PEDV分子生物學診斷技術具有很好的應用前景。但豬流行性腹瀉病毒全基因組結構還需要深入研究。疫苗研制的最佳構想應該包括安全、有效果、多價、成本低及保存和使用方便等，但要達到上述目標還需要一個漫長的過程。PED疫苗的研究已經取得了一些可喜的進展.隨著人們對病毒致病原認識的不斷深入，研制的PED疫苗也在不斷完善，相信不久的將來科學家們會研制出特別有效的疫苗來控制PED疾病的發生。參考文獻（1BrianDA,BaricRS.CoronavirusgenomestructureandreplicationJ）.C

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