1、植物甜蛋白馬賓靈(Mabinlinn)在大腸桿菌和食品級乳酸乳球菌中的表達及其活性研究馬檳榔(CapparismasaikaiLevl.)是我國特有的、唯一的在果實中富含甜蛋白的野生植物資源，其種子中所含的甜蛋白馬賓靈(MabinlinR)的甜度是同等重量蔗糖的400倍。馬賓靈在目前已發現的七種植物甜蛋白中具有最佳的熱穩定性和耐酸性,將其作為一種新型甜味劑在食品領域有著極為廣闊的市場前景。然而由于馬檳榔植物的稀缺性,無法大量獲得馬賓靈甜蛋白,限制了其在食品添加劑行業的廣泛應用。為了擴充馬賓靈的蛋白資源以及探討馬賓靈的活性結構形式,本研究以基因工程手段對馬賓靈基因進行剪切,將多種形式的重組馬賓靈

2、基因在大腸桿菌和食品級乳酸乳球菌兩種微生物表達系統中表達與分離純化,并在此基礎上分析了重組馬賓靈的甜味活性與熱穩定性,以期建立高純度的甜味活性馬賓靈的表達體系,為研發具備實用價值的馬賓靈新型甜味劑提供堅實的應用基礎與技術支撐。本研究根據馬賓靈的甜味活性結構特點,按照不同表達系統的特點和后期分離純化的目標將馬賓靈基因進行有針對性的剪切重組。分別將重組馬賓靈導入大腸桿菌和食品級乳酸乳球菌表達系統中,在大腸桿菌表達系統中分別建立了包涵體形式的重組馬賓靈和可溶性形式的融合重組馬賓靈的表達與分離純化體系,在食品級乳酸乳球菌表達系統中分別建立了重組馬賓靈的分泌表達和胞內表達的誘導表達體系。另外從馬檳榔種子

3、中分離純化了馬賓靈蛋白,將天然馬賓靈免疫新西蘭大白兔后經抗原親和純化制備了馬賓靈兔源多克隆抗體。對大腸桿菌和食品級乳酸乳球菌表達系統中誘導表達的重組馬賓靈進行了Western-blot鑒定,并且對從大腸桿菌中分離純化的重組馬賓靈進行了MALDI-TOF-TO分析、甜味活性分析和熱穩定性分析。主要的研究結果如下所述：1、從馬檳榔種子中經羧甲基纖維素層析柱分離純化活性馬賓靈,馬賓靈的提取得率和純度分別為9.82%和86.9%。采用純化的天然馬賓靈免疫新西蘭大白兔,經抗原親和純化制備了效價比達1：256000的馬賓靈兔源多克隆抗體。Western-blot鑒定結果表明制備的構象型馬賓靈兔源多克隆抗體

4、可特異性的識別天然和重組馬賓靈蛋白。2、三種剪切重組形式的重組馬賓靈MBL-BH、MBL-ABHf口MBL-AXBHE大腸桿菌表達系統中直接表達時，均形成包涵體形式的重組馬賓靈蛋白。在IPTG誘導濃度為0.8mmol/L或乳糖誘導濃度為10mg/mL誘導起始OD600為0.8、誘導時間為5h和誘導溫度為37c的條件下，誘導表達的三種重組馬賓靈包涵體蛋白含量最高。重組馬賓靈包涵體蛋白以2M尿素包涵體洗滌液洗滌后再經6M鹽酸月瓜包涵體變性液變性的效果最佳。純化的變性重組馬賓靈蛋白以0.2mg/mL的濃度在復性液pH為8、復性液甘氨酸濃度為40mmol/L、復性液精氨酸濃度為300mmol/L和復性

5、液氧化還原電勢為10：1的條件下通過尿素梯度濃度稀釋復性的效果最佳。重組馬賓靈MBL-BH,MBL-ABHf口MBL-AXB經鍥柱純化和尿素復性后，其中的可溶性重組馬賓靈的最終得率分別為1.79%、3.27%和2.76%,純度分別為85.4%、81.7%和83.5%。分離純化自大腸桿菌的重組馬賓靈MBL-BHMBL-ABHF口MBL-AXBH?Western-blot鑒定均能與馬賓靈兔源多克隆抗體發生免疫反應。重組馬賓靈MBL-BHMBL-AB即口MBL-AXB皖MALDI-TOF-TO分析鑒定為馬賓靈蛋白甜味活性分析顯示重組馬賓靈MBL-BHM有輕微舌t味感覺,甜度接近于同等重量蔗糖的100

6、倍。熱穩定性分析顯示重組馬賓靈MBL-BH勺熱穩定性較差。3、與分子伴侶SUMO蟲合的重組馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-AB大腸桿菌表達系統中融合表達時,兩種融合重組馬賓靈蛋白均有部分蛋白以可溶性形式存在。在IPTG誘導濃度為0.4mmol/L或乳糖誘導濃度為6mg/mL誘導起始OD60吻0.4、誘導時間為4h、誘導溫度為28c和誘導搖床轉速為150rpm的條件下誘導表達的融合重組馬賓靈可溶性蛋白含量最高。可溶性融合重組馬賓靈蛋白經鎳柱親和層析法純化,收集250mmol/L咪唑濃度洗脫下來的蛋白，重組融合馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-AB最終得率分別為3.78%和4

7、.23%,純度分別為76.3%和75.6%。分離純化自大腸桿菌的融合重組馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-ABWestern-blot鑒定均能與馬賓靈兔源多克隆抗體發生免疫反應。甜味活性分析顯示融合重組馬賓靈SUMO-MBL-B有輕微甜味感覺，甜度接近于同等重量蔗糖的100倍。熱穩定性分析顯示融合重組馬賓靈SUMO-MBL-B有一定的熱穩定性。4、重組馬賓靈MBL-B即口MBL-ABHfc食品級乳酸乳球菌表達系統中分泌表達和胞內表達時,培養基上清和菌體的可溶性蛋白中經Western-blot可分別檢測到重組馬賓靈甜蛋白。ELISA定量結果表明，重組馬賓靈誘導表達的最佳條件為Nisin誘導濃度為30ng/mL、誘導起始OD60M0.5和誘導時間為3h。重組馬賓靈（MBL-BHMBL-ABH食品級乳酸乳球菌表達系統中分泌表達的含量最高可達12.83Ng/mL和15.68仙g/mL,胞內表達時含量最高可達22.07祖g/mL和27.19祖g/mLo本研究成功的從馬檳榔種子中分離純化了活性馬賓靈蛋,并以此制備了高效價比的兔源抗馬賓靈的多克隆抗體。首次在大腸桿菌表達系統中分別建立了包涵體形式的重組馬賓靈和可溶性形式的融合重組馬賓靈的表達純化體系,同時也首次在食品級乳酸乳球菌表達系統中分別建立了分泌表達及胞內表達重組馬賓靈的食品級誘導表達體系。此外還建立了重組馬賓靈