1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上His標簽重組蛋白大量表達及純化一 篩選及鑒定 1 將構建好的連接產物進行轉化DH5 鑒定表達載體和目的片段的連接一般為10µL連接體系，此步轉化方法如下： 取100µL DH5感受態(tài)細胞，加入到10µL連接產物體系中冰上放置30min42準確熱激90秒冰上放置3min加入300µL無Amp+ 的LB培養(yǎng)基，37 100rpm/min振蕩培養(yǎng)1h將400L菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37溫箱中倒置培養(yǎng)過夜（1216 h），直至出現單菌落。2 陽性克隆的PCR鑒定方法如下 挑取單菌落于2

2、00L含Amp+LB培養(yǎng)基中（用2.0的離心管），搖床200rpm/min，37培養(yǎng)4h，待菌液渾濁后，取1L做菌液PCR鑒定。PCR擴增體系如下： 取1 L菌液作為模板反應體系如下：模板1 µL10×PCR反應緩沖液（含Mg2+ ）2 µLdNTP(2.5 mmol/L/each)1.6 µL上游引物（10 µmol/L）1 µL下游引物（10 µmol/L）1 µLTaq酶（5 U/µL）0.3 µLddH2O 13.1µLTotal20 µL條件：94預變性 10min

3、94變性 45s50退火 45s72延伸 1min，30個循環(huán)的擴增反應 72延伸 10 min4 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測：電泳上樣時：Marker DL2000上樣3µL 樣品（1µL loadingbuffer +6µL PCR產物混勻上樣）100V，20min；紫外透射儀檢測，出現目的帶的對應菌落為陽性克隆。（注意：記得保存菌種）3 陽性克隆質粒抽提 取陽性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液體培養(yǎng)基，37 200rpm/min培養(yǎng)3-4h，待菌液渾濁后，進行質粒抽提。質粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL離心管中12000rp

4、m離心30s，棄上清加800L STE懸浮沉淀12000rpm離心30s，棄上清重復STE漂洗沉淀的過程加入100L預冷的solution ，強烈振蕩混勻溫和加入200L solution （solution 現用現配），蓋緊管口快速顛倒5次，放置冰上2 min至溶液清亮而粘稠極溫和加入150L預冷的solution ，倒置溫和振蕩10s，冰上放置5 min12000rpm離心5 min取上清（400L），加入等量的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻12000rpm離心5 min取上清（350L），加入1/10體積（35L）的NaAc（3M）和2倍體積預冷的無水乙醇（700L）上下顛

5、倒5次，（無水乙醇在-20保存）室溫放置20min（-20沉淀效果更好）13000rpm離心10 min棄上清（小心倒出），用1ml 70%的乙醇貼壁沖洗漂洗沉淀13000rpm離心10min室溫放置讓乙醇揮發(fā)干凈用20lTE溶解質粒DNA，每20L體系中加入1L 1mg/mL的Rnase，37作用30min，1%瓊脂糖電泳定量檢測純度所用試劑：1、 STE：0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 1mmolol/L EDTA2、 solution ：50mmolol/L Glucose 25mmolol/L Tris-HCL（pH8.0） 10mmolo

6、l/L EDTA(pH8.0)3、 solution ： 0.2mol/L NaOH 1%SDS4、solution ：5mol/L KAc 60mL 冰醋酸 11.5mL 無菌水 28.5mL (最終K+的濃度為3mol/L，Ac-的濃度為5mol/L)4 BL21的轉化及誘導表達質粒轉化BL21感受態(tài)細胞方法如下： 取100µL BL21感受態(tài)細胞，加入1µL質粒冰上放置30min42準確熱激90秒冰上放置3min加入900µL無Amp+ 的LB液體培養(yǎng)基，37 100rpm/min振蕩培養(yǎng)1h取100L菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌

7、液完全吸收后，在37溫箱中倒置培養(yǎng)過夜（1216 h），直至出現單菌落。5 目的蛋白的誘導表達挑取單克隆菌落于3ml的LB液體培養(yǎng)基（含Amp+）中180rpm/min，37培養(yǎng)。待菌液濃度OD6000.6時開始誘導：1. 首先取出50µL菌液留樣2. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 3µL3. 30 180rpm/min 誘導4h收菌6 目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定1. 取700L菌液13000 rpm離心1min，棄上清2. 空菌對照及marker3. 加30L PBS和30L 2×SDS上樣緩沖液，用槍吹勻4. 沸水煮10min，稍離心

8、，將液體匯聚管底，取10µL上樣12%的膠 濃縮膠90V 10min 分離膠160V 50min 考馬斯亮藍染色 30min 脫色液脫色二 大量誘導表達1取300L菌液，加入到50mL LB液體培養(yǎng)基（含Amp+）中 180 rpm/min 37過夜2將50ml菌液全部加入到500ml LB液體培養(yǎng)基（含Amp+）中 200 rpm/min，37，大約2h左右，此時OD600約等于0.6開始誘導3. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 550L誘導條件：30 180rpm/min 誘導時間：4h收菌（取700L留樣電泳分析，是否表達出來及表達位置和表達量）三 細胞裂解1.

9、將550ml菌液，收菌前準確稱出瓶中（為計算濕菌重量）2. 分三次，4800 rpm/min離心20min，在用PBS洗滌一次，倒置用濾紙控干3. 稱全重，計算出濕菌重量4. 每克濕菌加5ml Lysis buffer（Tris：50mM Nacl：300mM PH:8.0）混勻轉移到50ml管內5. 每毫升菌液加1:500加0.1M PMSF6. 加入終濃度為1mg/ml的溶菌酶E，玻棒攪動20min7. -80 反復凍融3-5次（冰水混合物中融化）8. 每克濕菌加4mg脫氧膽酸（脫氧膽酸先用1ml Lysis buffer溶解），取樣30L準備電泳分析（玻璃棒37水浴中攪拌30min，此步

10、驟若是不可溶性蛋白可這樣處理，若是可容性蛋白可在冰水混合物中攪拌）9. 用注射器在冰水混合物中反復吹吸，使菌液不再成團，變得更加粘稠10. 超聲20min（每次超聲不得超過30s）11. 加終濃度5g/ml的DNase 和RNase A及終濃度10mM 的CaCl2和MgCl212. 室溫搖床作用30min，注射器反復吹吸13. 補加一倍體積的Lysis Buffer，同時加終濃度為1%的曲拉通。（平時常溫曲拉通儲存液濃度為20%，否則不宜溶解）14. 反復吹吸15. 13000rpm/min 20min16. 上清補加PMSF(1:500) 沉淀用bufferB 溶解同樣補加PMSF(1:5

11、00)Buffer B： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0Buffer C: NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:6.8（不含咪唑，咪唑現用現加，終濃度10 mM）咪唑2M（2M咪唑分裝-20保存）Buffer D： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0(咪唑終濃度100mM)分析：上清及沉淀還有樣品處理前的留樣，進行電泳分析鑒定目的蛋白是可溶的還是不可溶的以便選擇純化方式四 His標簽蛋白純化（可溶和不可溶性）可溶性蛋白純化（上樣前要將上清過0.22m的濾膜）1） wa

12、sh buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minwash buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:6.8 過濾0.22m除氣2） 上樣 流速0.3ml/min（注意蛋白濃度不宜過高，蛋白總量不得超過柱子載量）接一次流穿液，（取樣電泳）流穿液也再過一次柱子，接二次流穿液，留樣電泳一般可溶性蛋白：過一次柱子就可以將目的蛋白完全吸附，這與柱子有一定關系，第一次操作，最好將一次流穿液再過一便柱子。3） wash buffer（含20mM咪唑）洗脫雜蛋白 0.8ml/min，洗脫至少100ml，直到蛋白吸收曲線變平為止（取30L 電泳分析）4） Elution b

13、uffer 洗脫目的蛋白（含250mM咪唑）Elution buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:8.0過濾0.22m除氣流速0.3ml/min 收集蛋白 收集峰值 每管2ml 5） wash buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min6） 保存柱子時用20%酒精，47） 對純化的樣品電泳分析純度，紫外分光度法定量 蛋白濃度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260蛋白1:1000分別加入：0.1M PMSF0.5M EDTA 100× PH:7.5（即儲存液為100×，加入終濃度為1×

14、） 5M L-Arginine 100× PH:7.5（即儲存液為100×，加入終濃度為1×）分裝-20保存不可溶性蛋白純化1）沉淀用30ml buffer B溶解后，13000rpm 離心15min 上清過0.22m的濾膜2）Buffer B平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minBuffer B NaH2PO4 20mM；Nacl 500mM；Urea 8M；PH:8.03）上樣 流速0.3ml/min（注意蛋白濃度不宜過高，蛋白總量不得超過柱子載量）接一次流穿液，（取樣電泳）流穿液重復3-4次過柱子每次的流穿液都要留樣電泳分析不可溶性蛋白一般濃度較高，一次不能

15、讓柱子充分吸附，所以流穿液重復上樣4）Buffer C洗脫雜蛋白，流速0.8ml/min，洗脫至少100ml，直到蛋白吸收曲線變平為止，可用考馬斯亮藍G-250 監(jiān)測Buffer C NaH2PO4 20mM；Nacl 500 mM；Urea 8M；PH:6.8（含咪唑終濃度10 mM），一般咪唑現用現加，配好的2M咪唑分裝-20保存5）Buffer D洗脫目的蛋白（含100mM咪唑）流速0.3ml/minBuffer D：NaH2PO4 20mM；Nacl 500 mM；Urea 8M；PH:8.0(咪唑終濃度為100mM)6）收集目的蛋白，收集峰值，2ml/管7）蛋白跑電泳分析，含目的蛋白

16、的管子合在一起，透析復性。8） Buffer B平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min9） 保存柱子時用20%酒精，4不可溶性蛋白復性1）根據蛋白分子量大小，選擇合適的透析袋水煮30min-1h2）檢查透析袋是否漏，將蛋白裝入透析袋中透析，透析每12h換一次透析液具體操作：6M Urea4M Urea2M Urearefolding buffer 1refolding buffer 2pbs 1pbs 2pbs3pbs 4refolding buffer: 50mM Tris；pH 7.90.5mM EDTA50mM NaCl5% glycerol磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和0.24g KH2PO4，用HCl調節(jié)pH值至7.4，加水定容至1L，高壓下蒸氣滅菌20min，保存于室溫。注：pbs 4中加入了30% PEG20000此步透析中要格外小心，時刻關注不要有蛋白析出（肉眼可見白色析出的沉淀），達到一定濃