1、1siRNAs and miRNAs: Themes in Common6非編碼RNA 主要種類microRNAs (miRNAs)small interfering RNAs (siRNAs)Piwi-interacting RNAs (piRNAs)Long noncoding RNA(lncRNA)small nuclear RNAs (snRNAs)small nucleolar RNAs (snoRNAs)tRNA、rRNA5Science 296 1260 (2002)非編碼RNA的定義非編碼RNA( ncRNA)是指各種不編碼蛋白質的RNA。其中包括多種功能已知的 RNA，如tR

2、NA， rRNA;還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點是從組上轉錄而來，但是不翻譯成蛋白， 在RNA 水平上就能行使各自的生物學功能.4非編碼RNA的定義、種類中心法則RNA的發展歷程3John L. Rinn and Howard Y. Chang., Annu. Rev. Biochem., 2012主要內容1, 非編碼RNA的定義、種類2, siRNA的功能3, miRNA的功能4, lncRNA(長鏈非編碼RNA)的功能5,其它非編碼RNA（diRNA、piRNA）的功能2表達調控的新視角-非編碼RNA22. siRNAs發現歷程1990年，Rich Jorgensen 在矮牽

3、牛花中發現轉沉默（共抑制）1995年，Sun Guo 注入反義RNA及正義鏈RNA抑制線蟲par-1的表達； 三年后， Fire和Mello發展了通過RNAi 進行線蟲敲除的策略(PTGS)。此后，又在果蠅、錐蟲、渦蟲、無脊椎動物、脊椎動物、植物、真菌、斑馬魚及哺乳動物幾乎所有的 物細胞中發現了siRNA介導的RNAi現象。2001年Elbashir等 Nature上首次通過21個核苷酸的siRNA地在哺乳動物培養細胞中誘導特異性基因沉默。近年來，顯微注射，槍，工程誘導RNAi也成為反向遺傳學研究中的重要工具。121. siRNA概念siRNA ：是一種小RNA（21-25nt），由RNAas

4、e 中對雙鏈RNA具有特異性的酶-Dicer 而成。每一條鏈各有一個5磷酸基末端與一個3羥基末端，這種小RNA特異性的識別靶并發揮轉錄水平或轉錄后水平的沉默效應，最終高效特異的阻斷的表達，甚至能達到敲除的效果。11siRNA的功能1. siRNA概念2. siRNA發現歷史3. siRNA造成的RNAi機制4. siRNA的分類及作用機理10AGO蛋白的結構域及空間結構9Argonaute由siRNA介導的RNAi途徑中， Argonaute蛋白可以用內切核酸酶活性來沉默mRNA靶，這種過程被稱作切割。 Argonaute蛋白在進化過程中演變出了各種亞科蛋白。這些亞科蛋白可以識別各種不同類型小

5、RNA，從而在各種小RNA沉默途徑中發揮作用。RISC1. TRBP能夠招 募Dicer復合體miRNA形成RISC Ago22. PIWI結構域具有RNaseH樣的折疊情況， RISC中的酶切割活性中心3. siRNA是RISC完成特異性切割作用的向導.Dicer 蛋白的結構域及空間結構Dicer酶是RNaseIII型中的蛋白酶，可特異識別并切割以各種方式進入到細胞內的dsRNA. Dicer在RNAi及相關途徑中起重要作用，一方面可以切割外源dsRNA成為 siRNA來介導RNAi對外來核酸的抗性，另一方面可以內源序列成miRNA來調節體內表達，保證生物體的正常生長發育。Dicer主要由R

6、NA解旋酶結構域、PAZ結構域、RNase結構域和dsRNA結合區結構域。3RISC（RNA-induced silencing complex ）RISC由siRNA、 解旋酶、ATP、核酸 內切酶、核酸外切酶 等多種成分組成。活 化的RISC在單鏈 siRNA引導下識別互 補的mRNA，并在RISC中的核酸內切酶作用下從siRNA引導 鏈中心所對應的靶基 因位置切割靶mRNA， 最后可能再被核酸外 切酶進一步降解，從 而干擾表達。18效應階段siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing comp

7、lex，RISC)，并通過堿基配對結合到靶的序列上。 RISC RISC binding targeted RNA17起始階段第一步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被特異核酸酶Dicer切割成2123nt的和反義鏈組成的小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5磷酸和3羥基，且3端均有3個突出的核苷酸。16RNAi機制中siRNA發揮的沉默作用起始階段效應階段擴增擴散階段15 一方面結合mRNA的產物以siRNA作為引物 一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA. 以mRNA為模板 在依賴RNA的RNA聚合酶siRNA的

8、雙鏈解開變成單鏈 并和某些蛋白作用下出mRNA的互補鏈。新的長形成復合物。此復合物同與siRNA互補的 鏈dsRNA同樣可被切割生成大量的次級mRNA結合 使mRNA被RNA酶裂解。siRNA。次級siRNA又可進入-切割的循14環過程 進一步放大RNAi作用。3. siRNA造成的RNAi機制RNA interference（ RNAi） 在進化過程中高度保守、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發并導致 同源mRNA高效特異性降解的現象。34ta-siRNA的產生及作用過程Liang W Long M and Yijun Q Plant Physiology July 30 20124.trans

9、-acting siRNAs (ta-siRNAs) Allen等(2005)對擬南芥miR173靶的序列分析發現，靶編碼一系列siRNA，并且都含有siR255及序列相似的siRNA，而siR255又類似miRNA一樣反式作用于其下游靶PPR(pentatricopeptide repeat)類蛋白的，因此這類由miRNA并能產生siRNA的分別被命名為trans-acting siRNAl（TAS1）。反式作用干擾小RNA是新近在植物中發現的依賴于miRNA、長度為21個堿基的小RNA，對植物的生長發育過程具有重要的表達調控功能。tasiRNA的生物需要有miRNA介導的非編碼轉錄產物的切

10、割。hc-siRNA作用機制1. 產生 hc-siRNA在轉座子等重復DNA序列區域產生。2. 出核 hc-siRNA主要存在于細胞質中，并且大部分以游離的雙鏈形式存在3. 變構 AGO4在HSP90蛋白的幫助下結合雙鏈siRNA， 然后通過其核酸內切酶活性切割并降解其中一條鏈， 形成成 結合單鏈siRNA的AGO4效應復合體。siRNA的結合很可能導致AGO4構象發生變化， 出其核 信號，細胞因此可以選擇性的識別并轉運成AGO4/siRNA復合體至細胞核內。4. 入核 與AGO4蛋白結合形成效應復合體。AGO4/siRNA復合體可進一步招募DNA甲基轉移酶DRM2等組分，特異性地識別同源DN

11、A序列并介導甲基化修飾。意義hc-siRNA的產生和最終 功能行使都在細胞核中 進行，了以前人們 認為的RdDM通路完全 在細胞核內進行的成見。Ruiqiang Ye ，Molecular Cell, 20124. siRNA的分類及作用機理hc-siRNAs-Heterochromatic siRNAsphasiRNAs-Phased siRNAstasiRNAs-trans-acting siRNAs21siRNAs介導的RNAi作用特點：1. 高效性2. 濃度依賴性3. 高特異性4. RNAi對細胞調控機制的影響性：RNA干擾在有效地沉默靶 的同時，對細胞本身的調控系統沒有影響5.高穩定

12、性6. 遺傳性7. 放大效應8. 作用廣泛性20擴增擴散階段(放大效應) 模板 靶mRNA切割片段 引物 siRNA 產物 長鏈dsRNA 依次循環新的長鏈dsRNA同樣可被Dicer切割、降解生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進入-切割的循環過程，進一步放大RNAi作用。siRNA在RNAi途徑中發揮重要的作用，但隨著研究的深入發現的siRNA類型越來越多，發揮作用的方式也多樣性。19RNAi途徑中siRNA作用 movie5canonical miRNAs1. 水稻中，有6個DCL蛋白（OsDCL1、OsDCL2a/b、OsDCL3a/b 和OsDCL4），2. OsDCL1對于

13、水稻miRNA的產生有重要作用.幾乎所有 miRNA都是由DCL1剪切而來。3. 檢測來源于反向重復結構的siRNA數量變化發現，在dcl1 突變體中，siRNA數量沒有明顯變化，但在dcl4突變體中，來源于此結構的21 nt siRNA幾乎完全消失，表明OsDCL4對于這種siRNA的產生有重要作用。Bin Liu Plant Physiology 2005A2. miRNA的cmiRNAs-Canonical miRNAslmiRNAs-long miRNAsnat-miRNAs-Natural cis-miRNAs29近年來被鑒定的miRNAs越來越多至今超過17000 miRNAs已被

14、發現28microRNA的發現Victor AmbrosGary Ruvkun 第一個被發現的miRNA (lin-4)由哈佛大學的Victor Ambros發現的（1993） 第二個被發現的miRNA（let-7）由哈佛大學的博士后Frank Slack (Ruvkun）發現的（2000)271. microRNA概念及發現MicroRNAs（miRNAs）是在物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA， 其大小長約2025個核苷酸。通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。26miRNA的功能1. miRNA概念及

15、發現2. miRNA的3. miRNA介導靶沉默作用機制4. miRNA產生特點5. miRNA功能研究思路256 第一種是切斷靶的mRNA。miRNA與靶標 完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA植物中，大部分microRNA都以這種方式， 靶mRNA斷裂后，無poly（A）的的3端加上多個U并很快降解，含poly（A）的能穩定存在一 段時間(如擬南芥miR-171）。36microRNA對靶的抑制miRNARISC對靶 mRNA的抑制主要取決于它與靶 轉錄體序列互補的程度，有3種方式。結合抑切割抑制制:切割or 抑制35343. miRNA介導靶沉默機制33n

16、atural antisense miRNAs (nat-miRNAs)nat-siRNAs1 靶標是位于水稻細胞DNA反向鏈上它們直接面對的2 這類微RNA沒有存在于常見的研究用植物擬南芥中，只在葉植物中發現了這種新型的小RNA。Cheng Lu,PNAS,2008long miRNAs (lmiRNAs)1. lmiRNAs由另一個Dicer成員，DCL3切割產生，并與AGO4亞蛋白形成RISCs。2. lmiRNAs與AGO4的特異性互作不僅取決于lmiRNAs的5 末端核苷酸，而且依賴于上游lmiRNAs的產生機制。3. lmiRNAs不是在轉錄后水平調控Liang Wu，Molecu

17、lar Cell,201075.2 導入外源片段競爭miRNA，使其不能結合內源性靶Artificial target mimics of miR156WT35S:MIMI156b42Franco-Zorrilla JM, Nat Genet 20075.1 改變植物體中miRNA的表達量WT35S:miR156bThe 35S:miR156b plant, which is about 7 months old, has many more, but smaller, leaves41Schwab R, Dev Cell. 20055. 植物miRNA的功能研究思路miRNA的正常表達是植物

18、正常生長發育所必需的，如何研究miRNA對靶標的調控作用？研究思路5.1 改變植物體中miRNA的表達量。5.2 導入外源片段競爭miRNA，使其不能結合內源性靶。5.3 通過轉改變植物中靶mRNA 的序列使其具有抗miRNA降解的能力。404 miRNAs產生特點1 miRNA前體通過RNA聚合酶II轉錄生成，具有mRNA的結構特征。2 具有多順反子結構即一條pri-miRNA包含多個成熟miRNA的信息。3 miRNA可來源于外顯子,也可來源于內含子和非編碼序列。4 miRNA在組座位上分布，處于同一族的miRNA常共表達。5 對于同一miRNA，其功能常具有互補作用。6 不同miRNA可

19、同時調節同一靶mRNA。39 第三種是結合抑制具有以上兩種作let-7用模式：當與靶標基因完全互補結合時， 直接靶向切割mRNA； 當與靶標全互補結合時，起調節表達的作用。Target knockdown38 第二種是抑制靶的翻譯作用時與靶標不完全互補結合，進而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩定性，這種miRNA是目前發現最多的種類(線蟲lin- 4).在動物體內，大部分miRNA不能與靶的轉錄體完全配對，故被認為主要通過翻譯抑制的方式來調控靶。在植物中極少數的microRNA通過此方式來抑制靶。378作用機理Archetype I as signals, lncRNA expression ca

20、n faithfully reflect the combi-natorial actions of transcription factors (colored ovals) or signaling pathways to indicate gene regulation in space and time.Archetype II as decoys, lncRNAs can titrate transcription factors and other proteins away from chromatin or titrate the protein factors into nu

21、clear subdomains. A further example of decoys is lncRNA decoy for miRNA target sites.Archetype III as guides, lncRNAs can recruit chromatin-modifying enzymes to target genes, either in cis (near the site of lncRNA production) or in trans to distant target genes.Archetype IV as scaffolds, lncRNAs can

22、 bring together multiple proteins to form ribonucleoprotein complexes. The lncRNA-RNP may act on chromatin as illustrated to affect histone modifications. In otherinstances, the lncRNA scaffold is structural and stabilizes nuclear structures or signaling complexes.2.lncRNA作用機制47Long Noncoding RNAs定義

23、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)長度200個核苷酸缺少特異完整的開放閱讀框序列保守性差（物種特異性）表達量低和組織特異性無蛋白質編碼功能461.lncRNA的發現及概念Long Noncoding RNAs ，起初被認為是 組轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具有生物學功能。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默， 組印記以及染色質修飾，轉錄激活，轉錄干擾，核內 等多種重要的調控過程，這些調控4作5 用也開始引起人們廣泛的關注。lncRNA(長鏈非編碼RNA)的功能-組的暗物質1. lncRNA的發現及概念。2. lncR

24、NA作用機制。3. lncRNA作用特點。445.3 通過轉改變植物中靶mRNA的序列使其具有抗miRNA降解的能力改變靶重要堿基（同義突變），miRNA不能識別靶。439 lncRNA在多個水平上參與調控lncRNA可通過多種途徑、在多個水平調節的表達。（1） 轉錄前水平-甲基化修飾、組蛋白修飾等（2） 轉錄水平-干擾轉錄因子與啟動子結合等（3） 轉錄后水平- 作為小RNA的前體，以小RNA發揮切割靶的作用。（4） 蛋白水平-改變蛋白質活性或亞細胞等。54 種類、數量、功能都不明確在20世紀80年代，人們首次鑒定出lncRNAs。當前人們已經在多種哺乳動物組織中研究了大約100種lncRNA

25、s 。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是未知的。53相比蛋白編碼,更嚴格的功能限制大多數的lncRNAs在組織分化發育過程中， 都具有明顯的時空表達特異性， 人 小鼠的1300個lncRNAs進行研究，發現在腦組織中的不同部位，lncRNAs具有不同的表達模式。52進化速度快，序列的不保守性與編碼 相比， lncRNA序列保守性差，進化快，但啟動子區域相當保守。 同樣可以結合轉錄因子，局部染色質組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結構特征。分析發現，哺乳動物體內lncRNA達1 000多種， 可通過蛋白質編碼序列轉變為非編碼序列后轉錄而得到，或由去除了

26、外顯子的 序列轉錄而來， 其表達具有組織和時空特異性。與編碼蛋白質的相比，lncRNA序列的保守性較差。513 lncRNA作用特點 lncRNAs通常為長度200個核苷酸的RNA。具有mRNA樣結構，經過剪接，具有polyA尾巴與啟動子，多數由RNA聚合酶轉錄，發育過程中有動態的表達與不同的剪接方式，比編碼可塑性更大。50植物中已的lncRNA作用途徑49102. repeated-associated siRNA (rasiRNA)piwi-interacting RNAs重復序列相關小干擾RNA前體由重復元件編碼的，大部分都是轉座子或反轉座子序列，編碼的小RNA 沒有發夾結構，研究發現，

27、 rasiRNA 在異染色質重塑，穩定方面起作用。（RasiRNAs are called piRNA since 2007）piRNA因其可與名為PIWI蛋白的Argonaute蛋白相結合而得名。piRNA是單鏈非編碼小RNA,其長度一般為2433nt，通過特異性地與Piwi蛋白結合而發揮生物學作用。目前的研究表明, piRNA主要存在于哺乳動物的生殖細胞和干細胞中 通過與Piwi亞 蛋白結合形成piRNA復合物(piRC)來調控沉默途徑。這些研究結果表明小 RNA在物DNA雙鏈斷裂修復過程中具有保守的重要功能，并為人們對DNA雙鏈斷裂修復機理的認識提供了 性的新概念。59diRNA的產生依賴于PI3激酶ATR，RNA聚合酶IV和DCL（Dicer-like），其產生后被AGO2蛋白招募而起作用581. diRNA (DSB-induced small RNA)diRNAs大小