1、反義寡核苷酸化學修飾酶類藥物的研究進展 關鍵詞：化學修飾,靶向技術,序列選擇,靶向轉運摘要： 反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucletide,as ODN）類藥物是人工合成并經化學修飾的寡核苷酸（ODN）片段，能通過自身設計的特定序列與靶 mRNA結合，在基因水平干擾致病蛋白的產生。由于其高度的選擇性和較低的副作用，asODN類藥物已成為近年來藥物研究和開發的熱點。最近，as -ODN類藥物福米韋生（fomivirsen,Vitravene）通過美國FDA批準為第一個進入市場的反義藥物。其他asODN類藥物ISIS2302，ISIS3521CGP64128A和 G31

2、39等在臨床試驗中也表現出良好的療效。 asODN作為基因表達的反向抑制劑，首先必須具備三個主要條件：即它應有足夠的穩定性、對目的基因的選擇性以及對細胞的通透性和靶向性。滿足三個首要條件的方法主要是針對ODN在化學修飾、序列選擇、靶向轉運等方面加以改善。 反義寡核苷酸的化學修飾 不經修飾的ODN不論在體液內還是細胞中都極易被降解，不能發揮其反義作用。因而采用經化學修飾的ODN，以減少核酸酶對ODN的降解。對ODN化學修飾的方法主要針對三方面，即堿基修飾、核糖修飾和磷酸二酯鍵修飾。堿基修飾主要為雜環修飾、5-甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤；核糖修飾主要為己糖。2O-甲基取代核糖、環戊烷、構象核糖；磷酸二

3、酯鍵修飾主要為硫代和甲基代修飾等。 其中硫代寡核苷酸（phosphorothioate，PSODN）、混合骨架寡核苷酸（mixed backbone oligonucleic acid， MBO）和多肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）應用廣泛，成為具有代表性的第一、二、三代ODN。 硫代寡核苷酸 由于磷酸二酯鍵是核酶的主要靶點，因此采用硫化試劑將ODN磷酸二酯鍵硫化成為PS-ODN類結構，是增強ODN穩定性的有效途忡。PS ODN是迄今研究最深入、應用最廣泛的一類as ODN。作為第一代as-ODN藥物，PSODN只有良好的水溶性、穩定性及易于大量合成，基本能滿足臨床治

4、療的需要。與天然OON相比，PSODN通過細胞內吞作用進入細胞內平衡所需時間更長，最終細胞內濃度也更高；其t1/2一般都大于24h，極大地提高了對核酸酶的耐受能力。PSODN抑制基因的表達通過兩種方式，即誘導Rase H以降解目的 mRN或與目的mRNA形成雜交體而干擾mRNA的加工和翻譯。其副作用主要來自其攜帶的負電荷和免疫原性：由于PSODN帶有大量的負電佝，能與多種因子結合從而導致非特異效應。體外實驗表明， PSODN及其核酸降解物能與血清蛋白、細胞表向受體結合，或者進入細胞內與某些堿性蛋白質或酶結合，產生非特異效應。另外研究還發現，PS-ODN 及其核酸降解物中含有多個連續的胞苷磷酸鳥

5、苷（CgG）序列，會產生非序列特異性的抑制作用。 混合骨架寡核苷酸 MBO是人們根據不同修飾的OON特性而加以各種組合設計而成。與PS-ODN相比，MBO通過不同化學修飾的組合降低了硫代磷酸二酯鍵的數量，減少了自身攜帶的負電荷，降低了體內降解速度并改變了核酸降解物的種類，從而減少了由硫代導致的副反應；提高了與靶mRNA的結合能力并提高誘導RNaseH降解mRNA的能力。Zhang 等在大鼠試驗中，靜脈給藥后MBO在多種組織中均有分布，給藥48h后主要仍以完整的形式存在；比對照的PS-ODN在體內的穩定性、體內各組織的分布、代謝等方面均有提高；仍觀察到一些輕微副作用，如部分酶原凝血時間延長、淋巴

6、細胞增殖、有濃度依賴的補體溶血作用等，但程度要小于相同劑量的PS-ODN。 多肽核酸 PNA結構上是以2-氨基乙基甘氨酸為基本單元，堿基通過一個甲基聯基與類肽鏈骨架相連。由于結構PNA與DNA類似，其兩相鄰堿基間距及堿基與類肽鏈骨架間的距離均相近， PNA與DNA以及RNA與PNA之間均可形成Wat son-Crick配對。體外試驗證明，PNA與RNA結合 可抑制逆轉錄過程，與雙鏈DNA發生鏈侵入反應后，可有效阻斷限制性內切酶對酶切位點的識別和切割，從而阻斷蛋白的表達。與前兩代as-ODN相比，PNA具有更強的親和力及更好的特異性，往往更短的片段即可獲得相同的反義效果；具有良好的蛋白酶和核酸酶

7、抗性，在細胞培養液及體內不易降解，半衰期更長；經修飾后具有良好的細胞膜穿透性，其應用前景廣闊。 反義寡核苷酸的序列選擇 as-ODN必須與靶mRNA互相結合形成雜交分子才能發揮對目的基因的反向抑制作用，因而as ODN與其靶mRNA結合的親和力成為其發揮反義效力的首要因素。從理論上講，與mRNA互補的 ODN序列越長，其結合能力越強。但事實上，較長的ODN難以通透細胞膜并極易被降解，無法發揮反義作用。而且，體內的mRNA分子結構上具有高度的分子折疊，并含有大量結合的偶聯蛋白，人們很難預測那些未理藏起來易于as-ODN接近的序列。 對于體內mRNA結構的復雜性，人們在as-ODN 靶序列的選擇上

8、通常選擇一些優先序列：例如選擇啟動子編碼區附近或翻譯起始區作為靶序列；在原核生物中，針對SD（Shine-Dalgarno）序列及其附近區域的階as-ODN更有效；在真核生物中，針對5端非編碼區可能比針對編碼區的as-ODN更有效。 如果在優先區域選擇靶序列不能成功，或者其他區域的選擇更有價值，則需采用其他的方法確定靶序列：例如Bacon等采用"Walk"法確定敏感序列，從5端到3端合成一系列ODN，然后檢驗其反義能力，這種方法是有效的，但是人力物力投資巨大；Milner等在合成系列ODN基礎上，檢測它們與兔-球蛋白mRNA形成異二聚體的能力，方法簡單，但由于mRNA的折疊

9、在體內和體外有很大不同，其實用價值還有待于進一步的體內驗證；Ho 等采用半隨機化ODN文庫，探索具有RNaseH作用部位的候選mRNA靶序列，對ODN序列進行有效預計，結果與體內試驗有很好的相關性。 反義寡核苷酸的靶向轉運 as-ODN發揮其反義作用，必須在細胞內靶 mRNA結合部位達到有效濃度。而as-ODN一般是多陰離子化合物，大多經過多種吞噬方式進入細胞發揮其反義作用。由于這是一種耗能過程，并且轉運具有飽和性，要用很高的濃度才能在細胞水平觀察到對目的基因的明顯抑制作用。較低的細胞通透性使as-ODN很難在靶細胞內達到治療所需濃度。許多研究者針對as-ODN研制出多種良好的靶向轉運系統以提

10、高as-ODN的攝取速率和轉運特異性，極大的改善了as-ODN的細胞通透性和靶向性。 脂質體介導的靶向轉運 將as-ODN包埋于脂質體中是提高其細胞通透性的有效方法。目前，采用較多的為陽離子脂質體。當as-ODN被包裹于雙層結構的脂質體中時，首先減少了機體對藥物的生物轉化以及核酶的攻擊，增加到達靶細胞的有效濃度。脂質體自身帶有的正電荷使其更容易粘附于帶有負電荷的動物細胞表面，脂質尾則使其易于通過細胞膜的脂質雙層。 應用這種轉運系統應用的最大問題是脂質體對 as-ODN的包裹效率極低，一般只有23。如果增加脂質體的體積以提高包封率，反而會降低靶細胞對脂質體的攝取，并會降低復合物在血液中被動轉運的

11、效率。增加脂質體包裹效率的方法包括在脂質體復合物內引入融合基因蛋白或其他軛合物（如膽固醇等。Zelphati等將as-ODN的3端通過二硫鍵與膽固醇連接后，發現修飾的as-ODN與脂質體的結合能力提高了10倍，并且不影響其本身的反義效力，研究表明，與膽固醇偶聯是提高as-ODN脂質體包封率的有效途徑。 免疫介導的靶向轉運 免疫介導主要包括受體-配體介導和抗體-抗原介導。這種靶向轉運系統是指當as-ODN作用的靶細胞或組織含有一些專一性受體或抗原時，將其配體或抗體與ODN分子連接，經過特定的免疫識別作用使得as-ODN在靶細胞膜上某些特定區域富集，再通過細胞的胞吞作用實現藥物向細胞內的轉運。因此

12、，免疫介導不僅大大增強了對靶細胞的專一性，而且通過免疫結合使as-ODN進入細胞的轉移效率也大為提高。 免疫介導的靶向轉運大致可分為兩種類型：（1）針對靶向的機體組織器官所特有的受體或抗原進行免疫介導，如哺乳動物肝細胞存在特有的無唾液酸糖蛋白受體，通過此受體的免疫介導可將as-ODN特異導向肝臟以治療肝炎等疾病；（2）針對靶向的致病細胞表達的大量受體或抗原進行的免疫介導，如上皮細胞瘤表達過量的上皮生長因于受體，可以用來導入治療劑進入腫瘤細胞發揮作用。 實際研究中常將免疫介導與脂質體介導兩種方法結合使用，利用免疫脂質體為載體以特異轉運as- ODN。Renneisen等研究了作用于T細胞受體 C

13、D3分子的免疫脂質體包埋的as-ODN對HIV增殖的影響。結果發現，免疫脂質體包埋的as-ODN可有效抑制HIV的增殖，而僅用脂質體包埋或游離的as- ODN對HIV沒有活性。以免疫脂質體為載體的靶向給藥方式可能是將來對病毒、腫瘤實施靶向治療的理想方法之一。 毫微粒技術的應用 毫微粒是一種極小的顆粒，能攜帶藥物分布全身，直至到達太狹窄的不能通過的部位為止。毫微粒技術利用機體內毛細血管直徑隨器官不同和特異部位不同而異的特點，通過部位特異的毛細血管誘捕毫微粒而實現特異性轉運。Schwab等合成了 150220nm的毫微粒以吸附一段作用于點突變基因Haras mRNA的as-ODN，研究結果表明，這種毫微粒可有效地抑制Ha-ras基因的表達，所需濃度僅為游離as-ODN的1，進一步的體內試驗還證明該化合物可以抑制裸鼠身上Haras基因依賴性腫瘤的生長。 結語 as-ODN作為一種新型的基因治療藥物，在心血管疾病、腫瘤、感染和炎癥等多種疾病的治療上均可得到廣泛應用。隨著研究的深入，as-