1、思 考 題1細胞工程實驗室的基本組成與要求是什么？一、實驗室組成（1）基本實驗室準備室/化學實驗室功能： 就是進行一切與實驗有關的準備工作要求： 寬敞明亮，通風條件好 ，地面便于清潔并應防滑處理。接種室/無菌操作室功能： 是進行接種、繼代、細胞融合等無菌操作的場所。要求： 封閉性好，干燥清潔明亮， 防止空氣對流。外應設緩沖室、更衣室，防止微生物感染。培養室功能： 是對接種到培養瓶的離體材料進行控制培養的場所。要求： 是要能控制光照和溫度，應保持干燥和清潔。（2）輔助實驗室 根據具體的實驗需求而定。細胞學實驗室生化分析室攝影室及暗室（3.） 移栽設施/溫室要求：配置人工光源并且能夠控制室內溫度，

2、為試管苗的正常生長提供適宜的環境。2外植體消毒的基本方法是什么？ 3無菌操作在植物離體培養中的作用是什么？4. 配制培養基時，加入一定量的植物生長調節物質，它們在離體培養過程中有哪些作用? 激素調控的一般規律是什么？植物激素或生長調節劑（ growth regulators）包括：Ø 生長素類Ø 細胞分裂素類(CTK)Ø 赤霉素類 (GA)Ø 乙烯（ Eth)Ø 脫落酸(ABA)§ 其中前三者為正向激素，后兩者則為負向激素。常用的主要有生長素類和細胞分裂素類兩大類。§生長素類（ auxin）： 在作用或結構上類似于吲哚乙酸的

3、一類物質的統稱。生長素是最早發現的植物激素。作用： 誘導愈傷組織形成，促進細胞的分裂和伸長，誘導根原基的發生和根系的生成，有調運養分的效應。使用濃度0.110mg/L。常用的生長素有:吲哚乙酸 (IAA)、2， 4，二氯苯氧乙酸 (2,4-D) Ø吲哚丁酸 (IBA) 奈乙酸 (NAA)Ø細胞分裂素類(cytokinin,CTK) ： 是一類促進細胞分裂的植物激素，細胞分裂素都為腺嘌呤的衍生物。作用： 促進細胞分裂和分化，誘導不定芽的形成，促進胚狀體的發育，延緩組織的衰老，打破頂端優勢，有利于芽的增殖，常用于繼代和增殖培養。使用濃度0.110mg/L。常用的細胞分裂素有：&

4、#216;激動素 (KT) Ø6-芐基腺嘌呤 (6-BA/BAP) Ø玉米素 （ ZT）異戊烯氨基嘌呤 (2-ip) Ø噻重氮苯基脲 （ TDZ） 5. 常用的植物細胞培養基種類有哪些？各有什么特點?MS培養基無機鹽含量較高，微量元素種類較全，濃度也高。其養分的數量和比例較合適，離子平衡性較好，具較強的緩沖能力，培養過程中較穩定，可滿足植物的營養和生理需要。其中它的硝酸鹽含量較其它培養基為高。廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養，效果良好。有些培養基是由它演變而來的。6 培養基3和（4） 24 含量高，VB1含量高，不含鉬。目前在國內已廣泛應用于小麥、水

5、稻及其它植物的花粉和花藥培養和組織培養。5培養基3含量高，有機物含量較高，但含有較低的銨，這可能對不少培養物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在5培養基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物H培養基大量元素約為1/2MS，微量元素減少但含量增加，維生素種類較多。用于多種植物的花藥、胚培養。hite 培養基特點：是無機鹽濃度較低，有機成分含量也相對較低。適于生根培養。-培養基有機成分較復雜。它包括了所有的單糖和維生素。廣泛用于原生質體和融合體的培養。6簡要說明MS培養基的基本組成。7. 配制培養基時，為什么要先配母液?如何配制母液?在組織培養工作中， 配制培養基是日常工作，為了簡便起見，將培

6、養基配方中的藥品配成一定倍數的濃縮液，用時稀釋，這種濃縮液就是母液貯備液。母液儲備液可一次稱量供一段時間使用， 簡單方便，不僅可以提高培養基中微量成份稱量的準確性， 還可以減少工作量，提高效率。§ 母液貯備液的配制要求ü大量元素母液配制： 10x， 20x， 50xü微量元素母液配制： 1000xü鐵鹽母液配制： 100x或200x , 分別溶解EDTA-Na2 與FeSO4· 4H2O，再充分混勻，貯存在棕色瓶中ü有機母液配制：可以分別配制100200X，也可以混在一起配制ü肌醇一般單獨配置成100x。ü生長調節

7、物質配制：分別單獨配制成母液，儲存于冰箱。一般濃度為0.11 mgml。并注意不同激素需加入不同助溶劑8. 如何判斷配制好的培養基是否良好？9. 植物培養基和微生物培養基有什么不同？第三章1植物細胞全能性的含義是什么？其實現的途徑是什么？每個植物生活細胞無論是體細胞還是生殖細胞，均具有該物種全部的遺傳信息。每個植物生活細胞均具有發育成完整植株的潛在能力。細胞全能性僅是一種能力或可能性，不是所有具有全能性的細胞都能進行全能性的表達。離體培養條件下，植物體細胞、性細胞、原生質體、經過遺傳信息修飾的細胞都可能實現細胞全能性2什么是細胞脫分化和再分化？其實現的條件是什么？脫分化（ dedifferen

8、tiation） ： 培養條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態或分生細胞狀態的過程。再分化（ Redifferentiation）： 脫分化后的分生細胞在特定的條件下，重新回復細胞分化能力，形成各種不同類型的細胞，并經歷器官發生或胚胎發生，進一步發育成完整植物體的過程細胞脫分化的條件： 創傷、外源激素。3什么是器官發生，器官發生的方式有幾種？各有什么特點？直接和間接器官發生的區別是什么？器官發生：是指培養條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定芽（ adventitious buds）、不定根（ adventitious roots）等器官的過程5. 器官發生的影響因素有哪些？1、

9、起始材料ü母體植株的遺傳基礎ü外植體的類型ü生理狀態、取材方式等2、培養基成分激素（ Skoog-Miller模式）、有機及無機成分3、培養條件光照、溫度、濕度等6體細胞胚的概念、含義及特點是什么？體細胞胚(somatic embryo)或胚狀體（ embryoid） ：離體培養下沒有經過受精過程，但經過了胚胎發生和發育過程所形成的胚的類似物（不管培養的細胞是體細胞還是生殖細胞）體細胞胚的含義：Ø在離體培養范圍使用，以區別于無融合生殖胚；Ø體細胞胚起源于非合子細胞，以區別于合子胚；Ø體細胞經過了胚胎發育過程，以區別與離體培養中器官發生

10、形成個體的途徑體細胞胚發生的特點Ø 具有明顯的雙極性： 即在發育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，具有根、芽兩極分化的特性；Ø 存在生理隔離現象：胚狀體與母體組織或與外植體的維管組織無解剖結構上的直接聯系，處于相對獨立的狀態；Ø遺傳的相對穩定性：單細胞起源；發生數量大， 增殖率高：可再生次級胚7體細胞胚發育的過程是什么？它和器官發生形成的芽、合子胚有什么區別？8什么是胚性和非胚性愈傷組織？9外源激素對體細胞胚胎發生有什么影響？生長素是誘導體細胞胚的主導因子。 體細胞胚胎發生中，外源生長素的使用規律，在大多數植物中是相似的。誘導愈傷組織或胚性愈傷組織，

11、均需要高濃度的生長素；當球型胚形成后，則需要降低生長素水平才能完成體細胞胚的繼續發育；生長素的這一應用規律與胚胎發育過程中內源激素的變化是一致的10如何進行愈傷組織的繼代培養？多次繼代培養的愈傷組織其分化能力如何？為什么？愈傷組織在誘導培養基上生長一段時間后，保持其的旺盛分裂能力、均一的細胞群體，避其死亡，必須進行繼代培養。繼代培養時期：旺盛分裂時期；培養方法：分割成小塊，約5mm3大小；培養方式： 固體培養、液體培養。培養基： 與初代培養相同，或適當降低激素濃度或調控激素比例。愈傷組織形態發生潛力的喪失u原因： 生理學說： 培養組織或細胞中的內源激素失衡。遺傳學說： 遺傳物質在培養繼代過程中

12、由于變異等原因而發生了改變或是突變。競爭學說： 細胞對于生長素抑制全能性表達的作用變得比較敏感；反復的繼代培養中，非胚性細胞的群體將會逐步增加，而胚性成分則逐漸減少。11.人工種子的概念及其結構。人工種子又稱合成種子 （synthetic seeds）或體細胞種子 （somatic seeds）：是指將植物離體培養中產生的體細胞胚，或能發育成完整植株的分生組織（ 不定芽、愈傷組織、胚狀體、原球莖、小鱗莖、微型薯等）包埋在含有營養物質和具有保護功能的外殼形成的適宜條件下能夠發芽出苗的顆粒體。12.人工種子研制有什么意義？如何看待人工種子的發展前景及面臨的困難？人工種子的研制意義（ 1）人工種子能

13、代替試管苗快速繁殖，開創了種苗生產的又一新途徑。與試管苗相比是一種高效快速的繁殖方法，避免移栽困難，易于實現機械化操作，便于儲運。（ 2）對優異雜種種子、自然條件下不結實或制種困難的植物可以不通過有性制種而快速獲得大量種子。（ 3）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調節物質、菌肥、農藥等，可人為地影響控制作物生長發育和抗性。人工種子存在的問題l 許多重要植物還不能培養出大量的高質量的體細胞胚。l 現有的人工胚乳和種皮還不夠理想， 不能有效地防止微生物的腐蝕。l 人工種子的貯藏有待進一步完善。l 人工種子的成本遠高于自然種子發展前景人工種子的發展前景是客觀的它將是農業中一種革命性的繁殖系統，相信

14、該技術會得到逐步完善，建立多種模式來研制人工種子，并逐步擴大應用范圍。第四章1.離體快速繁殖一般可分為哪幾個階段？簡述其操作的一般程序。繁殖過程劃分為四個階段無菌培養物的建立（ stage1）程 序：外植體的選擇、消毒、接種和培養增殖培養（ stage2）方 法：反復進行、連續的培養試管苗生根（ stage3）方法： 降低或去除細胞分裂素，增加碳源。植物類型不同，壯苗培養時可以以單個的枝或叢狀的芽苗進行。試管苗的移植（ stage4）移栽的一般步驟：1） .開瓶鍛煉：放在較強光照條件下或溫室中，打開瓶口，鍛煉12周左右；2） .試管苗就可以從培養瓶內取出，小心的洗去根上附著的培養基，移栽進合適

15、的基質中；3） .精心管理，直至成活；4） .進一步培育成商品苗。2. 快速繁殖中，培養物的增殖途徑有哪幾種?各有何特點？（1）、腋生枝型以頂芽和腋芽發育進行增殖的特點：利用外植體上已有的芽分生組織，促使其萌發形成枝條或芽， 方法簡單，能高度保持遺傳穩定性，繁殖速度較慢。適用于絕大多數植物的繁殖，對具有特殊觀賞價值的嵌合體(chimera)園藝植物來說，也是唯一能夠保持其原有嵌合特性的繁殖途徑。（2）、不定芽型不定芽增殖的特直接分化途徑產生的不定芽：遺傳穩定、繁殖速度較快間接分化途徑產生的不定芽：容易產生變異點：利用不定芽增殖對于繁殖園藝上的嵌合體（ chimera）植物來說，容易引起嵌合體的

16、分離。3、體細胞胚（ somatic embryo）型特 點：最理想的繁殖方式，增殖系數高；遺傳相對穩定；具有雙極性結構，可以免去生根步驟；有利于實行機械化操作。目前只有少數植物能產生胚狀體，再生植株有返幼特性3.試管苗有什么特點？試管苗的特點Ø葉的特點 ： 葉面積較小，功能不全，易失水，合作用能力低。Ø根的特點 ： 無根或生根率低，根與莖輸導組織不相通，根吸收功能低。Ø莖的特點： 有的植物莖的輸導組織發育也不完善，木質化程度低。Ø光合作用能力： 增殖階段，試管苗基本處于異養狀態，很少或不進行光合作用；生根階段，異養兼自養。4.外植體選擇應注意哪些問題？

17、供體植株的基因型： 遺傳性狀是否優良？培養難易？實用價值？Ø外植體類型： 取材難易？再生難易？遺傳變異？Ø增殖類型： 誘導的難易？繁殖速度？遺傳穩定性？5.植物離體快速無性繁殖有什么特點？主要適用于哪些植物類型？起始材料少，生長周期短、繁殖速度“快” ，每年以數萬倍乃至數百萬倍的速度進行繁殖，不受自然條件干擾，實現工廠化育苗；p生產無病毒種苗，防止品種退化； 體積微小、不攜帶病原菌，便于儲運和種質材料交換，減少病蟲害的傳播；能夠有效地保持優良品種的特性，使原來難以通過無性繁殖的植株進行無性繁p殖。已廣泛應用于花卉、 蔬菜、 果樹、藥材和林木的種苗生產。6.防治植物病毒病有哪

18、些方法？物理方法： X射線、紫外線、超短波、高溫熱處理等。鈍化病毒，從而達到抑制病毒蔓延的目的?；瘜W方法：采用化學抑制劑，干擾病毒在植物體內的復制。生物學方法：選用抗病毒品種、采用種子繁殖或莖尖培養等方法。7.簡述莖尖分生組織培養脫毒的一般方法。（1）供體植株的選擇和預處理供體植株的選擇： 了解植物病毒種類及分布，確定莖尖大小，材料的典型性，外植體健康程度等。預處理： 莖尖培養可與熱處理、化學療法相結合。（2）莖尖組織的分離頂芽、側芽等表面消毒解剖鏡下無菌操作去除幼葉、葉原基切取含1-2個葉原基的生長點（ 0.10.2mm） 即刻轉入培養基。（3）莖尖分生組織的培養常用的培養基有MS、 Whi

19、te、 Morel、農事場、革新等配方8.影響莖尖分生組織培養去除病毒的因素都有哪些?9.病毒檢測的方法？1、 指示植物鑒定法2、血清學鑒定法3、電子顯微鏡檢查法4、分子檢測法10.如何進行無病毒苗的保存和繁殖？第五章 植物細胞培養和次生代謝產物生產1.植物單細胞培養的方法有哪些？1、平板培養（ plating culture）2、懸浮培養（ suspension culture）3、看護培養（ nursing culture）4、微室培養（ micro-chamber culture）5、飼養層培養（ feeder layer culture）2.一個好的懸浮細胞系有哪些特征？Ø

20、分散性良好：懸浮培養液中的細胞團較小。Ø 均一性好：細胞形狀和細胞團大小大致相同。Ø 細胞生長迅速：細胞生長量一般23d甚至更短時間便可增加一倍3. 植物細胞大規模培養有哪些培養系統？各有什么特點？1、分批培養培養系統封閉，只允許氣體和揮發性代謝物質與外界交換；ü培養基體積固定，當其中的營養物質耗盡時，細胞即停止生長；ü為使成批培養的細胞不斷增殖，必須在懸浮培養液達最大重量時盡快進行繼代培養；ü用適當的攪拌方法使游離細胞和小細胞團在培養液中均勻分布；操作簡單，可直接放大。ü 2、連續培養通過調節流入和流出培養液的速度可使培養細胞生長速

21、度相對一致，形成一個相對穩定的培養狀態，使細胞保持在對數生長期。一直有細胞收獲，但濃度不高，細胞分裂快，易變異，開放式的培養易造成污染，對設備復雜，技術要求較高。4. 植物細胞固定化的常用方法有哪些？為什么說植物細胞固定化培養更有利于次生生物的生成？按照其支持物不同可分為兩類包埋式固定化培養系統：常用的支持物有瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、膠原蛋白、聚丙烯酰胺等；附著式固定化培養系統：支持物采用尼龍網、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。5. 培養條件下植物細胞生長與次生產物合成的關系有哪幾類？生長偶聯型： 產物合成發生在細胞生長過程中，到達靜止期后合成停止。Ø非生長偶聯型： 產物合成出現在細胞生長

22、停止時。Ø中間型： 產物合成出現在細胞生長開始下降時合成，細胞處于對數生長期或停止生長期時產物都不合成。6.影響植物次生產物合成的因素有哪些？通過哪些途徑可以提高植物培養細胞次生代謝產物的產量？細胞系： 選擇穩定高產的細胞系。培養工藝：誘導子的添加、前體飼喂、添加競爭途徑代謝產物抑制劑、培養基和培養條件優化與控制等。培養技術： 固定化培養技術、兩步培養法、兩相培養技術。 培養設備： 選擇或設計合適的生物反應器。第六章 植物原生質體培養與體細胞雜交1. 原生質體、亞原生質體、核質體、胞質體的概念。原生質體(protoplast) ：去掉細胞壁的細胞或是由質膜包裹的具有生活力的裸露細胞。

23、亞原生質體(subprotoplast)： 在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成一些較小的原生質體，它可以具有細胞核或沒有細胞核。核質體(nuclearplast)： 由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的小原生質體。胞質體（ cytoplast） ： 不含細胞核而僅含有部分細胞質的原生質體2. 原生質體培養的方法。3. 為什么原生質體要培養在等滲培養基中？培養過程中如何管理？原生質體培養過程中的管理及時添加新鮮培養基Ø 逐步降低培養基的滲透壓Ø 及時調整培養基中的激素成份4. 影響原生質體培養的主要因素有哪些？（1）、原生質體的活力（2、）原生質體的起始

24、密度（3、）原生質體的營養和環境（4、）基因型5. 細胞融合有哪幾類？（1）自發融合（ spontaneous fusion） ：去壁后的同種原生質體之間常發生融合形成同核體，頻率一般在830%之間。它是由于不同細胞間胞間連絲的擴展和粘聯造成的，不屬于細胞雜交的范疇。（2）誘導融合：過人工誘導的方式，使不同來源的原生質體之間發生融合，形成異核體.6. 簡述PEG融合與電融合的原理及各自特點。PEG的作用機理：PEG分子具有輕微的負極性，可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果使原生質體發生粘連。在洗脫過程中， PEG將被洗掉，導致質膜表面電荷

25、重排。粘連的質膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導致一個原生質體的負性電荷部位與另一原生質體的正性電荷部位相連而導致融合。PEG誘導融合的特點優點：q融合成本低，勿需特殊設備；q異核率較高， 可重復性強；qPEG誘導的融合過程不受物種限制；q毒性低。缺點：q融合過程繁瑣；q一些植物種原生質體質膜性質強弱不一,常出現對PEG敏感,而破碎的現象；qPEG的分子量大小,濃度高低的使用不當也可影響融合的效果電融原理：q當原生質體處于電導率很低的溶液中時，通電后電流即通過原生質體，在非均勻的交變電場中時，發生雙向電泳而進入電場反應強的區域，同時，原生質體在電場作用下，發生極化而產生偶極子，使原生質體沿電場線

26、運動，細胞緊密接觸排列成串；然后給予短暫的高壓脈沖，導致接觸面的細胞膜擊穿，隨后緊密接觸的細胞膜發生結合，導致細胞融合。為了穩定這個過程，在短期內需要施加交流電壓。（ 2）電融合的優點：ü不存在對原生質體的毒害問題；ü融合效率高，重復性好，融合率達60以上；ü融合技術操作簡便，對融合原生質體數易于控制等。 7. 原生質體融合的基本過程是什么？膜融合、胞質融合和核融合8. 雜種細胞的選擇方法有哪些？1. 細胞系互補選擇法2. 物理特性差異選擇法3. 生長特性差異選擇法9. 體細胞雜種的鑒定方法有哪些？10. 什么是細胞質雜種？胞質雜種有什么作用？（三）細胞質雜種（

27、cybrid）細胞質雜種： 指具有一個親本的核，而細胞質為雜合或另一親本的體細胞雜種。由以下途徑產生對稱融合： 融合后的某一階段一個親本的核或染色體被排除。不對稱融合： 使一個親本的核失活或去核。細胞質雜種的意義：為核外遺傳物質交流重組及研究核質互作提供了機會。第七章 植物花藥和花粉培養及單倍體育種1通過離體培養獲得單倍體的途徑有哪些？花藥培養花粉培養未授粉子房/胚珠培養2花藥培養中如何選擇外植體？（ 1）供體材料選擇：供試材料的遺傳背景：選擇易培養的材料、雜合性的材料。供試材料的生理狀態：開花期的早晚、生長環境、營養狀態等（ 2）花粉的發育時期選擇：只有花粉發育到一定時期對離體培養最敏感，才

28、可能被誘導產生愈傷或胚狀體。一般情況下，對大多數植物來說，在單核期的花粉比較容易培養成功。單核中晚期到有絲分裂期是最適培養時期。3花藥培養與花粉培養有什么不同？共同點： 培養目的相同，獲得單倍體植株。n不同點： 花藥培養屬于器官培養；而花粉培養屬于細胞培養；花粉培養沒有藥壁組織干擾，易于觀察雄核發育的全過程，技術更復雜4花藥培養過程中花藥為什么要經過低溫處理？（1）降低了小孢子新陳代謝，延長花粉的壽命,中斷正常的配子體發育，促進花藥營養成分的轉運；（2）低溫能改變紡錘絲的軸向, 破壞紡錘絲的微管蛋白而阻止紡錘絲形成，打破有絲分裂正常過程, 導致細胞分化；（3）阻止了細胞在預處理時的細胞周期，一

29、旦培養在25度-28度下重新返回有絲分裂；（4）低溫、饑餓脅迫作用。5何謂花粉的二型性和E花粉？天然花粉群體（同一花藥）中，存在兩類不同的花粉。一類為正常花粉，它們的細胞質較濃，發育較一致，染色較深；另一類為異?；ǚ?，其特征是花粉體積較小，細胞質較淡、染色較淺，發育遲緩 (Dunwell， 1992)。Sunderland等在研究花藥培養的發育途徑中發現后一類花粉具有雄核發育能力，形成花粉胚，因此稱為胚性花粉或E花粉6花粉植株的發生主要有哪些途徑？（1）培養初期小孢子的發育途徑1、小孢子的發育途徑2. 營養核發育途徑3. 生殖核發育途徑4. 由生殖核、營養核共同發育途徑（2、）培養晚期小孢子的

30、發育過程通過胚狀體形成花粉植株通過愈傷組織分化形成花粉植株7. 單倍體的特點是什么？體細胞染色體數減半；生長發育弱，體形小、各器官明顯減??； 雌、雄配子嚴重敗育，有的不能進入有性世代。8. 花藥培養的一般程序？（1.）材料準備（2）.花藥接種及誘導培養（3.）分化培養（4）.生根、壯苗培養及馴化移植（5.）單倍體植株的鑒定及其二倍化第八章、植物胚胎培養1胚胎培養、胚培養、 “ 胚挽救” 的概念。胚培養（ embryo culture）：指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養基上進行培養的技術。胚挽救” 技術：一些植物由于胚發育不良或中途敗育等生殖障礙，導致種子不能萌發；在遠緣雜交中

31、， 雜種的不親和性，使雜種胚在發育過程中途敗育等；可以利用胚胎培養技術，分離發育不良的種子，或即將敗育前的種胚進行培養，促使胚繼續發育至成熟，使雜交育種或遠緣雜交獲得成功，這種技術稱為“胚挽救” 技術胚胎培養：對植物胚及胚器官（胚乳、胚珠、子房）的離體培養。2. 胚培養的類型有哪兩種？離體胚培養有什么意義？胚培養一般包括幼胚培養和成熟胚培養兩種方式。植物胚培養的意義（1、）用于胚的挽救（2、）打破種子的休眠，提早結實，縮短育種年限（3、）使生活力低下或無活力的種子萌發（4、）克服珠心胚的干擾，使植物合子胚正常發育（5、）種子活力的快速測定（6、）誘導胚性愈傷及建立高頻再生體系（7、）用于理論研

32、究3. 幼胚培養時胚的發育方式有哪幾種？各有何特點？（1、）胚性發育(embryonal development)/合子胚發育幼胚接種到培養基上以后，仍然按照在活體內的發育方式發育，最后形成成熟胚，再按種子萌發途徑出苗形成完整植株。（2、）早熟萌發(precocious germination) 幼胚接種后，離體胚不繼續其胚性生長，而是在培養基上迅速萌發成幼苗，通常稱之為早熟萌發。（3、）脫分化形成愈傷組織(callus)幼胚在離體培養中首先發生細胞增殖，形成愈傷組織。愈傷組織可分化為胚狀體或不定芽。4什么是早熟萌發？如何克服？幼胚早熟萌發：在含有無機鹽、 有機物和蔗糖的培養基上，離體培養的幼

33、胚越過正常胚胎發育階段， 在未達到生理和形態成熟的情況下， 萌發長成幼苗， 稱早熟萌發。 早熟萌發成的幼苗往往畸形、細弱，甚至不能存活防止幼胚早熟萌發的方法： 提高培養基滲透壓胚齡越小要求的滲透壓（ 糖濃度） 越高；提高無機鹽濃度， 可加入適量的NaCl以提高滲透壓， 濃度一般為0 20 4， 超過0 8對胚有毒害作用；加人1 l5 5甘露醇提高滲透壓， 甘露醇可以部分地代替蔗糖， 使幼胚在等滲條件下繼續胚性發育ü5在實際操作中如何確定胚囊的發育時期？最好的辦法是根據胚囊發育時期和花粉發育時期的相關性來確定胚囊發育時期6植物胚乳有哪些類型？胚乳培養的最適宜時期是什么時間？胚乳培養有什

34、么作用和意義？被子植物胚乳按發育初期是否形成細胞壁可三種類型：A、核型胚乳（ nuclear type）B、細胞型胚乳（ cellular type）C、沼生目型胚乳（ helobial type）胚乳發育時期可分為：早期、旺盛生長期和成熟期， 旺盛生長期是取材的最佳時期。意義：（1）再生植株多為三倍體，產生無籽果實；（2）可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體植株；Ø（3）研究胚和胚乳的關系及胚乳組織的功能；Ø（4）胚乳細胞是研究淀粉、蛋白質和脂類天然產物代謝途徑的理想系統；Ø（5）胚乳培養再生植株證明了全能性理論7離體授粉、受精的意義是什么？簡述其一般方

35、法?？朔h源雜交不孕克服自交不親和性誘導單倍體植株用于花粉生理和受精生理的研究胚珠授粉方法哺育法：將胚珠表面先蘸滿有助于花粉發然后撒上花粉進行培養。該法是解決胚珠存活率和花粉發芽、花粉發生矛盾時的做法。柱頭接近法：將花粉撒在本種植物的柱頭上，切下柱頭接種在培養基上，然后在柱頭周圍接種異種植物裸露胚珠，花粉在本種植物的柱頭哺育下發芽，花粉管伸長并進入胚珠受精。該法使解決花粉發芽和胚珠培養在培養基組成上發生矛盾時所采用的方法子房授粉方法：花粉涂抹法：毛筆粘取花粉，涂抹于柱頭，或在剝離子房時用柱頭直接粘取花粉后培養?；ǚ蹜乙鹤⑸浠蛞敕?：在子房壁或頂端切開一個小口，把花粉懸液用無菌微量注射器注入，

36、或引入子房，進行培養。ü花粉懸液： 10-20mg/L硼酸+5蔗糖，每滴懸液含花粉100-300粒第九章 植物體細胞無性系變異及突變體篩選1體細胞培養物的遺傳變異有何特點？（1）、體細胞無性系變異的普遍性變異可發生在各種培養類型中；變異發生在各種植物的培養中。（2）、體細胞無性系變異的局限性與自然發生的變異、理化誘變的變異類型相似。表型上： 主要是植株形態、生長勢、育性、某些抗性等性狀的變異；生理生化上： 容易出現同功酶譜、次生代謝的消長等變異；遺傳上： 涉及單基因或多基因性狀、隱性或顯性突變。3、體細胞無性系變異的嵌合性嵌合性： 指同一有機體中同時存在有遺傳組成不同的細胞，它是組織

37、培養中常見的現象。2哪些因素會影響培養物的遺傳變異？1、供體植物供體植物倍性水平：正常二倍體的穩定基因型：遺傳背景純合的穩定外植體來源：分化程度高的易變異2、 培養基及培養方式培養方式、激素及其它附加成分均會誘導體細胞變異的發生。3、 繼代培養的時間及植株再生方式繼代時間越長，細胞變異的幾率就越高；頂芽和腋芽的再生方式變異少，間接再生方式變異多。3從細胞學和分子生物學機制上理解體細胞無性系變異的機制。細胞層次上：染色體數目與結構的變異1、 DNA核內重復復制： DNA在核內重復復制，但不發生細胞分裂，其結果是染色體組數增加，形成同源多倍體。2、染色體斷裂與重組： 結果是在體細胞中出現染色體易位

38、、缺失、倒位等多種類型的結構變異。3、非正常有絲分裂： 結果出現染色體的非整倍性變異分子層次上：點突變DNA 總量變異轉座因子的激活 DNA 甲基化變化細胞器DNA 的修飾4體細胞無性系變異的誘導和選擇方法。培養細胞的誘發變異誘變方法1）物理誘變2）化學誘變3）復合因子誘變4）轉座子插入誘變體細胞突變體的篩選方法（1）在田間從再生植株中選擇有用的細胞突變體通過田間觀察、考種來發現和選擇有用性狀的變異植株，是一種最簡單、直接的方法。（2）在細胞水平利用選擇壓選擇有用的細胞突變體在細胞、愈傷組織或器官培養階段向培養基中加入選擇壓，從而選擇出有用的抗性細胞系。5體細胞無性系變異的應用途徑。Ø

39、; 農業上： 創造育種中間材料或直接篩選新品種；Ø 次生代謝物生產中： 高產細胞系的篩選；Ø 理論研究中： 遺傳研究、發育生物學研究、生化代謝途徑研究1. 動物細胞工程無菌操作的基本要點有哪些？1）紫外線只對能照射到的部位有消毒殺菌作用，故臺面上的物品不要放置過多或重疊放置；紫外線照射期間臺面上勿放置培養用品和培養用液等，以免受射線影響；紫外線對臺面流動的空氣無意義，空氣的消毒靠超凈工作臺的空氣過濾裝置。（2）燒過的器械要冷卻后才能使用，如鑷子應冷卻后才能夾取組織，否則可能造成組織細胞損傷；塑料、橡膠器件宜用75%酒精擦洗，勿將酒精接觸里面。膠塞、橡皮頭等過燈時時間要短，以

40、免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。（3）已吸過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內培養液中的蛋白質等成分燒焦后會產生有害物質，吸管再用時會將其帶如培養液中；（4）開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細胞；（5）進行培養操作時，不要用手觸及已消毒物品，如不慎接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換（6）吸取不同液體、處理不同的細胞要用不同的吸管，以避免液體間、細胞間的交叉污染。（7）面向操作野時勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾沫把細菌等帶入工作臺面造成污染。（8）操作人員應注意自身安全。（9）操作完畢后，清理物品，75%酒精擦洗臺面。2.動物細胞培養液的主要成分有哪些

41、，在離體培養中的作用是什么？動物細胞對培養基要求高葡萄糖、必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、細胞生長因子及激素、貼附因子等。1.葡萄糖： 碳水化合物是細胞生長主要能量來源,其中有的是合成蛋白質和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脫氧核糖,丙酮酸鈉和醋酸等。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養動物細胞時，幾乎所有的培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。2、氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。在培養基中添加至少12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，在

42、缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡.3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養基常有的成分。4.無機離子與微量元素：培養液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡.此外,通過提供鈉,鉀和鈣離子,幫助細胞調節細胞膜功能.培養液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通?？赡褪?60mOsm/kg 320 mOsm/kg。標準培養液的滲透壓在此范圍內波動.細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。 5、生長因子和激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細

43、胞的狀態（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。 6 其它 水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細胞表面特性促使其附著生長的作用。3.常用的培養動物細胞的培養基的種類有哪些？1天然培養基 血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS），一般濃度10。 雞血漿，雞胚浸出液：含纖維蛋白原和一

44、些營養成分 水解乳蛋白 鼠尾膠原優點：營養成分豐富，培養效果良好。缺點：成分復雜，個體差異大，來源有限2、合成培養基人工合成培養基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)細胞培養基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)細胞培養基系列(3)RPMI-1640細胞培養基系列(4).M199細胞培養基系列 (7)F-10,F-12細胞培養基系列(8) DMEM-F123、無血清培養基 4.無血清培養在實驗研究中有什么特殊意義？血清在動物細胞培養中有什么作用？使用無血清培養基的優點 (1）可避免血清批次間的質量變動

45、，提高細胞培養和實驗結果的準確性、重復性。（2）避免血清源性污染。（3）避免血清組分對實驗研究的影響。（4）有利于體外培養細胞的分化。（5）可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。血清在動物細胞培養中的作用（1）營養 提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養基所缺乏的營養物質。（2）提供結合蛋白，結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。 （3）提供貼壁細胞固著于適當的附著面所需的貼壁因子和伸展因子，使細胞很好地貼壁（4）保護 提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。一些細胞，如內皮細胞、

46、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。（5）解毒 血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 5.目前常用的合成培養基有哪些？有哪些優點？人工合成培養基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)細胞培養基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)細胞培養基系列(3)RPMI-1640細胞培養基系列(4).M199細胞培養基系列 (7)F-1

47、0,F-12細胞培養基系列(8) DMEM-F12優點：提供近似體內的生長環境，又便于控制和提供標準化的生存環境。6.BSS有哪些功能？常用的BSS有哪些？1、 水與平衡鹽溶液 balance saline solution,BSS）： 1）培養用水:體外培養的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養用水。配制培養用液應使用經石英蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。存放時間一般不應超過2周。 2). 平衡鹽溶液：主要是由無機鹽

48、、葡萄糖組成。作用：提供緩沖系統，維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定提供細胞生存所需的能量和無機離子成分。用于洗滌組織、細胞的漂洗、配制其他培養用液。幾種常用的BSSRingerPBSEarleHanksD-HanksD-Hanks與Hanks的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌第十二章 動物細胞與組織培養技術名詞解釋： 1、原代培養 原代培養(Primary Culture)：亦稱初代培養，指直接從機體取出的細胞或組織進行

49、第一次培養的過程。2、傳代培養 繼代培養（ Secondary Culture ）：亦稱傳代培養，從原代培養的細胞繼續轉接培養稱繼代培養. 3、接觸抑制 細胞從接種到長滿底物表面后，由于細胞繁殖數量增多相互接觸后，不再增加。一般的正常細胞并不互相重疊于其上面而生長；但是，轉化細胞或癌瘤細胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經過而重疊生長。4、密度抑制 細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制導致細胞分裂停止。5、細胞克隆

50、6、細胞系 7、細胞株8、動物細胞固定化培養問答題：1、 體外培養細胞有哪些類型及各自特點？在體外按照培養細胞的形態不同，主要可分為以下幾類：成纖維細胞型、上皮型細胞、游走型細胞、多形型細胞 （1）成纖維細胞型：本型細胞的形態似在體內生長的成纖維細胞；形態：長梭形，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞核位于中央，胞質向外伸出2-3個長短不同的突起，中有卵圓形核.生長特點：細胞一般并不緊靠相連；生長時呈放射狀、漩渦狀走向，細胞間間隙較大。來源：由中胚層間充質組織起源的組織.如人胚肺細胞。如：真正的成纖維細胞 心肌，平滑肌 （2）上皮型細胞形態:扁平狀，不規則。細胞貼壁后呈不規則多角形，

51、中央有扁圓形核，細胞彼此緊密相連成單層細胞，呈現“鋪路石狀”。生長特點: 易相連成片相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少脫離細胞群單獨行動。來源:內胚層和外胚層。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細胞，血管內皮細胞等。Hela細胞呈現為典型的上皮細胞型。 （3）游走型細胞： 不常見，具有類似巨噬細胞樣的特征。本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規則。此型細胞不很穩定，有時亦難和其它型細胞區別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯成片后，可呈類似多角型或成纖維細胞形態。如單核巨噬細胞系統

52、的細胞中的顆粒型白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等。 （4）多形型細胞：形態上不規則的細胞，不常見，一般分胞體和胞突兩部分，胞突細長形類似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規則。如神經組織細胞如神經元、神經膠質細胞等。非貼附型細胞懸浮型細胞：指細胞在體外培養時不必貼壁，可在培養液中懸浮生長。 見于少數特殊的細胞，如血液白細胞、淋巴組織細胞、雜交瘤細胞轉化細胞系、某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。形態特點：胞體始終為球形。優點：生存空間大，培養效率高，利于大量生產，與培養基充分接觸無需消化傳代，易于收獲細胞。缺點:不如貼附生長型觀察方便，而且并非所有的培養細胞都

53、能懸浮生長;純化不方便，不能通過離心將死、活細胞分離。貼壁細胞經懸浮適應后也可以長期懸浮培養3、兼性貼壁細胞實際情況下，所培養的細胞并不一定呈現某種典型的形態，能影響細胞形態的因素很多，在不同培養條件下可以互相轉變，細胞形態學特征僅是對培養物判斷或識別的一種參考性指標，如果想明確某一培養物的確切類型，必須借助于更為特異的鑒定方法。2.體外培養的細胞需要什么樣的條件？1、恒定的溫度:37 2、pH：最適為7.27.4 3、氣體 需要O2、CO2 （95%空氣、5% CO2）二氧化碳既是細胞代謝產物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的pH值.4、營養：要求高，需要氨

54、基酸、維生素、輔酶、核酸、激素、生長因子等。5、無菌2、 細胞系的生長過程包括哪些主要階段？每一生長階段各有什么特征？(1)原代培養（初代培養）特點：這個階段細胞比較活躍，有細胞分裂，但不旺盛；原代細胞培養通常為異質性(2)傳代期特點:細胞增殖旺盛，在細胞整個生命期中此期的持續時間最長， 一般情況下，可傳代1050代； 反復傳代可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化；能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型；細胞應在初代或傳代早期凍存為好；十代內凍存。(3)衰退期 此期細胞雖仍存活，但增殖很慢或基本停止，細胞形態輪廓增強，進而細胞發生衰退、死亡。3、 每代細胞的生長曲線包括哪幾個主要時期？各期細胞有什

55、么特點？潛伏期2）指數生長期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。持續35天。 細胞生長增殖狀況可以細胞群體倍增時間及細胞分裂指數等來判斷。在此階段，若細胞處于理想的培養條件，將不斷生長繁殖，細胞數量日漸增加。細胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養器皿底物，提供細胞生長的區域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制而細胞運動停止、密度抑制而細胞終止分裂。細胞不再繁殖而進入平臺期。3生長停滯期。特點：細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續存活一定的時間。若及時分離培養、進行傳代，將細胞分開接種至新的培養器皿并補充以新鮮培養液，細胞將于培養器皿中成為下一代的細胞而再次繁殖。否則細胞因中毒而發生死亡。4、衰亡期 達到穩定生長期的細胞群體，由于生長環境的繼續惡化和營養物質的短缺，群體中細胞死亡率逐漸上升，以致細胞死亡數超過新生細胞數，群體中活細胞數下降。4、 動物細胞原代培養的方法？舉例說明培養的基本過程。懸滴培養法 旋轉管培養法 灌注小室培養法 培養瓶培養方法 培養板培養法 克隆培養法5、 貼壁細胞傳代時采用何種方法，其技術關鍵是什么？6、 為保證好的凍存復蘇效果，需要考慮那些問題？慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。在細胞凍存時