1、綜述尿路致病性大腸埃希菌疫苗的研究進展曹陽，建殿軍關(guān)鍵詞：尿路致病性大腸埃希菌；疫苗；進展中圖分類號:R378.21文獻標志碼：A文章編號：1009-7708(2014)06-0545-05UpdateonthedevelopmentofuropathogenicEscherichiacolivaccineCAOYang,WEIDianjun.(DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211China)盡管有正常的尿液流動、強大的生理屏障以及一系列的宿主防御系統(tǒng)，但是人類

2、的泌尿道仍然是最常見的細菌感染部位。大多數(shù)尿路感染最初的表現(xiàn)是膀胱炎,進而引起急性腎盂腎炎.在某些嚴重的情況下.細菌可以突破腎臟的E皮和內(nèi)皮屏障進人血流，導致全身性感染和膿毒癥雖然有多種細慎可以感染人類泌尿道，但超過80%尿路感染是由尿路致病性大腸埃希菌（uropathogenicEscherichiacoliUPEC）引起的。UPEC不同于腸道正常菌群中的大腸埃希菌.它編碼一些額外的基因和毒力因子，包括毒素、黏附素、鐵攝取系統(tǒng)、代謝酶和結(jié)構(gòu)成分，便于感染宿主的泌尿道?？股厥悄壳爸委熌蚵犯腥镜淖畛Ｒ娛侄?，但反復抗生素治療可以引起細菌耐藥率的大幅度提升，同時破壞患者體內(nèi)的正常菌群，導致繼發(fā)感染

3、。2000年后與2（）世紀90年代相比,UPEC對某些哇諾胴類藥物的耐藥率上升超過50%,對阿米卡星的敏感率下降超過了20%,而且多重耐藥菌株比例明顯增多。國際膀胱炎相關(guān)的抗生素耐藥性流行病學調(diào)查（ARESC）顯示，超過10%引起膀胱炎的大腸埃希菌為多重耐藥菌。因此，采用-種更廉價、更有效的手段勢在必行，而以尿路感染中最常見的UPEC為靶位進行疫苗開發(fā)的研究在國內(nèi)外正處于熱點之中。作者單位：天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科，天津300211.作者簡介：普陽（1979），男.碩士，主管技師.主要從事醫(yī)院感染及分子流行病學研究.通信作者：魏殿軍，E-mail；weidianjun.一、UPEC疫苗概況成

4、功的UPEC疫苗需要有以下的特點：應有高度的免疫原性，感染時在宿主體內(nèi)能被細菌所表達，同時能暴露在細菌的表面便于宿主免疫系統(tǒng)接近并識別，而且它應該是病原體特異性的，避免宿主免疫系統(tǒng)攻擊自身胃腸道中的正常共生的大腸埃希菌。在設計疫苗時，還要考慮到UPEC種群的異質(zhì)性，因為普遍存在于UPEC菌株的核心毒力因子尚有待確認。此外，它還能誘導宿主在泌尿道產(chǎn)生強大的黏膜免疫應答。為了更好地建立這種免疫應答，新型的抗原呈遞系統(tǒng)和免疫佐劑也正處于研究之中孔二、表面多糖疫苗和其他革蘭陰性桿菌一樣，UPEC的細胞表面富含多糖其中包括有保護作用的脂多糖（O抗原）和莢膜多糖（K抗原）。脂多糖與莢膜多糖作為UPEC的毒

5、力因子可以使其逃避宿主的免疫攻擊，如調(diào)理吞噬和補體介導的細胞毒作用。近期研究顯示，UPEC的英膜多舫與脂多糖可以遮蔽細菌表面莢膜下的表位，阻止宿主抗體的識別，意味著表而多糖還可以通過其他的機制影響宿主的免疫應答。早期尿路感染疫苗的研究主要集中在這些表面多糖上，而且在上行尿路感染的動物模型中確實激發(fā)了宿主的保護性免疫應答然而大腸埃希菌的表面多糖存在大量的抗原異質(zhì)性，包括167種O血清型和80多種K血清型明。盡管某些（）抗原和K抗原在UPEC中較為普遍，但僅依靠這些表面多糖抗原研制針對所有UPEC都有效果的疫苗還是有巨大困難口門。此外，許多UPEC的莢膜多糖免疫原性較差，它們可以通過與宿主交叉共有

6、結(jié)構(gòu)組分逃避免疫攻擊。例如，英膜抗原KI存在于大約30%腎盂腎炎UPEC菌株中.由多聚2-8連接唾液酸構(gòu)成U”.在人神經(jīng)細胞黏附分子的糖類構(gòu)成中可以找到相同的組分。人類的免疫系統(tǒng)針對白身抗原有保護機制，阻止其多聚a-2-8連接唾液酸特異性抗體的產(chǎn)生，K1陽性的UPEC得以逃避宿主的免疫監(jiān)視。其他如英膜抗原K5也有類似的機制免疫原性低和高度的異質(zhì)性是阻礙尿路感染多糖疫苗發(fā)展的主要原因。三、多菌株全細胞裂解物疫苗含有滅活病原體裂解物的疫苗可以有效地激活宿主產(chǎn)生保護性免疫.如百日咳、霍亂和傷寒滅活全帽體疫苗。現(xiàn)在已有4種全細胞/細胞裂解物疫苗用于尿路感染，但效果不明顯。其中.Urovac疫苗設計的目

7、的是提供廣泛的保護，它包括10株滅活的尿路病原體：6株UPEC.奇異變形桿隋、摩根摩根菌、糞腸球菌和肺炎克雷伯菌各1株。Urovac疫苗中的UPEC菌株含有兒種毒力因子，包括溶血素，1、P和S型菌毛.CNF1,幾種鐵載體以及大腸埃希菌CFT073毒力島。同時包含的血清型有（）1,4,6,17,75.77；K13,5,13,95和H1,5.7,333】。有反復尿路感染的志愿者在肌內(nèi)注射1劑Urovac疫苗后的12個月內(nèi)，感染復發(fā)率較未注射疫苗的人群顯著下降山】。OM-89/Uro-Vaxorn是另一種類似的疫苗，為1K株UPEC膜蛋白凍干混合物。Uro-Vaxom為膠囊制型，每日口服，已通過幾組

8、雙盲、安慰劑對照臨床試驗證明其安全性和有效性一份涉及5項臨床研究、總計601例女性患者.90d療程的薈萃分析結(jié)果顯示，在預防尿路感染反復發(fā)作上Uro-Vaxom比安慰劑明顯有效Urvakol和UROstim是第3、4種全細胞疫苗，為口服藥片，每H給藥，2種疫苗均包含滅活的尿路致病萌混合物.包括大腸埃希菌、奇異變形桿菌和糞腸球菌，兩者的區(qū)別是Urvakol包含銅綠假單胞菌，而UROstim包含肺炎克雷伯菌。來自于動物和患者的研究結(jié)果顯示，接種后兩者都具有免疫刺激活性，在患者的血清、尿液和唾液中均有疫苗特異性抗體，同時有細胞因子的產(chǎn)生。但兩者預防夏發(fā)性尿路感染的作用還未被確認，完整的臨床試驗也還沒

9、有完成。四、基因工程疫苗除了全細胞裂解物疫苗正在進行臨床試驗外.基于UPEC轉(zhuǎn)基因菌株的疫苗也處于研究之中。為了搞清是否UPEC免疫原性較差的表面多糖阻礙了宿主體液免疫應答的產(chǎn)生，Russo等將1株經(jīng)基因改造的UPECCP923免疫小鼠.該菌株由于轉(zhuǎn)座子的插入不能產(chǎn)生莢膜和脂多糖，將甲醛滅活的CP923鼻內(nèi)免疫小鼠后，與免疫野生型親代菌株CP9相比，小鼠的體液免疫應答顯著增強，而旦均為直接針對非莢膜、非脂多精的抗體.對于UPEC這種異質(zhì)性高的菌株，CP923確實為一種令人滿意的疫苗購o然而將CP923疫苗鼻內(nèi)免疫小鼠模型后,與接種PBS緩沖液相比，并不能顯著保護小鼠免受C內(nèi)的人工感染進一步的體

10、外結(jié)合與殺菌試驗表明.CP923的保護失敗主要是由于CP9表而多糖的干擾。UPEC萌株普遍具有莢膜和（）抗原，這些表面多糖的潛在作用就是遮蔽非多糖表位，降低抗體結(jié)合的效率。鄭玲等將UPECF268P閑毛黏附素Pap（；與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）重組構(gòu)建融合蛋白GST-PapG皮下注射免疫小鼠，與接種PBS緩沖液相比，小鼠體內(nèi)相應抗體水平明顯升高，腎臟培養(yǎng)菌量明顯減少.對小鼠尿道UPECF268上行感染具有一定的免疫保護作用。五、黏附素疫苗UPEC編碼大量的黏附素.主要是指那些利于細菌附著或侵入宿主細胞的表面蛋白.例如萌毛。UPEC相比于腸道正常大腸埃希兩.其基因組中含有更多的菌毛操縱子理論上

11、如果抗體結(jié)合菌毛就能阻止細菌的黏附,預防定植。由于黏附在感染中的關(guān)鍵作用，菌毛自然就成為了UPEC疫苗研究的首要靶位。然而，迄今為止僅有一小部分UPEC菌毛用于尿路感染疫苗的研究.包括P、Dr和1型菌毛。PaPG位于菌毛的頂端可以結(jié)合P血型腎上皮細胞表面Gal（a1-4）Gal特異性鞘糖脂，在UPEC定植人腎組織中可能起到關(guān)鍵的作用。在鼠類和靈長類上行尿路感染模型中.利用P菌毛亞基免疫動物發(fā)現(xiàn)，其預防腎感染有效】。然而，單-的PaPG在UPEC膀胱定植中作用有限,必須同時有其他組件的疫苗才能提供足夠的保護。Dr菌毛結(jié)合人類腎小管基底膜和腎小球囊的4型膠原和DAF/CD55。感染Dr萌毛陽性的U

12、PEC小鼠與感染Dr菌毛敲除變異株的小鼠相比，前者腎內(nèi)細菌載隋更高,持續(xù)時間更長,腎小管間質(zhì)性腎炎更明顯口刁。用純化的Dr菌毛免疫小鼠可產(chǎn)生高效價的抗Dr抗體，并明顯降低尿路感染相關(guān)的病死率，但不影響膀胱或腎臟的定植率，將Dr陽性UPEC與Dr免疫后的小鼠血清預孵育后再感染小鼠，發(fā)現(xiàn)膀胱和腎臟的細菌黏附明顯減少，但當Dr陽性UPEC與Dr免疫后的小鼠尿液預孵育后，未發(fā)現(xiàn)抗UPEC結(jié)合活性.I。改變Dr抗原的接種方式或途徑，有可能會提高Dr菌毛疫苗的功效。1型菌毛的FimH通過與膀胱上皮尿溶蛋白的甘露糖殘基結(jié)合，介導UPEC黏附到膀胱上皮細胞。一種經(jīng)基因敲除后FimH缺失的變異UPEC萌株不能結(jié)

13、合人類和小鼠的膀胱上皮通過藥物或宿主自身產(chǎn)生的抗體干擾1型曲毛介導的UPEC與膀胱上皮的黏附，從而預防或治療膀胱炎，這一發(fā)現(xiàn)激勵著研究者進一步開發(fā)FimH疫苗。以FimHt（FimH截短模式，能與甘露糖結(jié)合）或FimCH復合體（伴侶蛋白FimC結(jié)合完整的FimH蛋白）免疫小鼠，與僅用佐劑免疫的對照組相比，前者能夠明顯保護小鼠免受人為膀胱UPEC感染，并降低定植細菌載址為原來的1/100-1/1000C24以FimHt免疫小鼠口j以產(chǎn)生大量并持久的體液免疫應答以及高水平的FimH特異性尿I以FimCH免疫殊猴可以激發(fā)強烈的全身體液免疫應答.保護3/4的帝猴免受人為尿路感染，而僅用佐劑免疫的對照組

14、無任何保護作用自從開始FimCH臨床試驗后的10年間，關(guān)于UPEC1型菌毛的進一步研究，使人們對其在人尿路感染中的作用有了更深的理解。對來自活動性尿路感染患者的菌株進行轉(zhuǎn)錄分析顯示，編碼1型菌毛亞基的基因在人尿路UPEC感染時并非高表達。1型菌毛的表達是階段性改變的，因為它的啟動子位于一個可逆的元件上，決定Firn表達的開與關(guān)，這種變化可以使入侵的UPEC躲避免疫監(jiān)視。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)靶向FimH凝集素結(jié)構(gòu)域的抗體并不阻礙FimH黏附，實際上反而可能增加FimH與甘露糖的親和力.并且FimH在發(fā)生構(gòu)象改變時抗體還會脫落技。近期有研究顯示，UPEC的基因表達在小鼠與人可能不同，雖然上行尿路感染

15、小鼠模型對于設計疫苗和評估有效性很有價值，但是要篩選到更有希望的UPEC疫苗，還需要更完整地掌握人體發(fā)生尿路感染時UPEC毒力因子的基因表達情況。六、毒素疫苗滅活的細菌毒素被稱作類毒素。目前很多兒童計劃免疫的疫苗都是這種類毒素疫苗，例如無細胞百白破疫苗就含有白喉和破傷風類毒素。UPEC基因組含有多種編碼毒素的基因，包括a溶血素、細胞密性壞死因子1、細胞致死性腫脹毒素，分泌轉(zhuǎn)運毒素Sai、Pic和Tsh。許多毒素與尿路感染時癥狀的嚴重程度有關(guān)，如炎性反應增加、膀胱上皮細胞脫落及腎損傷.但是沒有一種毒素對于尿路感染必不可少，因此都不適于作為理想的疫苗。將a溶血素肌內(nèi)注射小鼠,然后人為感染UPEC,

16、發(fā)現(xiàn)無明顯的保護作用但值得注意的是，與PBS對照組相比，以a溶血素免疫小鼠確實能夠明顯減少腎損害。雖然類毒素疫苗可能在減少尿路感染發(fā)病上作用不明顯，但對于降低某些高危人群感染嚴重程度上可能有一定的效果。七、鐵攝取系統(tǒng)疫苗幾乎所有的生命形式都需要鐵，鐵是多種酶的重要輔因子，這些酶在初級、次級細胞代謝以及正常的細胞生理過程中都有十分重要的作用。UPEC能夠定植到宿主尿路也要依靠鐵攝取系統(tǒng)。雖然人體內(nèi)含有大量的鐵，但大多數(shù)都不能被侵入的微生物所攝取.因為它們與血紅蛋白的攜氧血紅素結(jié)合，或者以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式儲存起來。宿主體內(nèi)游離鐵的缺乏是阻礙微生物生長的主要原因，那些成功的細菌病原體的一大特

17、點就是能夠規(guī)避這一障礙口9：。UPEC能夠在鐵缺乏的宿主尿路中生存，主要是通過h.調(diào)鐵攝取系統(tǒng)的表達，該系統(tǒng)能夠合成和分泌鐵螯合有機小分子鐵載體。鐵載體對三價鐵有高度的親和力，能夠同宿主蛋白爭奪鐵。一旦鐵被攝取形成復合體，三價鐵載體就通過外膜受體被運送到細菌內(nèi)部，加以利用維持細菌的存活。除了表達自身的特異性外膜鐵受體，UPEC還可以表達針對宿主含鐵分子（如亞鐵血紅素）以及其他微生物（如真菌鐵載體）的外膜受體。與大部分腸道正常大腸埃希萌僅編碼很少的鐵攝取系統(tǒng)不同，UPEC表達大量的鐵攝取系統(tǒng)如。例如UPEC簫株CFT073的基因組就編碼14種外膜鐵受體及3種鐵載體。許多外膜鐵受體都具有成為理想疫

18、苗的特點：它們暴露于細菌表面，感染時表達，并且在UPEC中普遍存在。迄今為止，已有7個UPEC外膜鐵受體處于預防尿路感染疫苗的研究之中，包括IroN、IreA、luiA、FyuA、Iha、Hma和ChuA。其中IroN.IreA、lutA、FyuA和Hma對保護小鼠模型免受UPEC感染的效果明顯，表明外膜鐵受體是很有希望的一類新型UPEC疫苗在人工UPEC感染小鼠模型中，皮下免疫變性的salmochelin鐵載體的外膜鐵受體Ir。、，對腎臟有明顯的保護作用，并且產(chǎn)生強烈的IroN特異性血清IgG應答，但沒有誘導產(chǎn)生明顯的全身或黏膜IgA反應，對于膀胱的保護也不明顯2】，考慮可以通過加入佐劑或改

19、變接種途徑來改善。氣菌素外膜鐵受體lutA以霍亂毒素為佐劑鼻內(nèi)接種小鼠，發(fā)現(xiàn)對膀胱和腎臟都有明顯的保護，并且誘導產(chǎn)生的lutA特異性尿路IgA明顯增加人但氣菌素的產(chǎn)地在UPEC菌株中可能并不充足，因此限制了lutAUPEC疫苗的應用26）。耶爾森桿萌素外膜鐵受體FyuA結(jié)合弗氏佐劑皮下免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)能明顯保護UPEC感染引起的致命性膿毒癥小鼠模型免于死亡叫。研究者不僅關(guān)注細萌自身鐵載體的外膜受體.而H.將宿主的亞鐵血紅素細菌外膜受體也作為研制疫苗的目標。亞鐵血紅素受體Hma以霍亂毒素為佐劑鼻內(nèi)接種小鼠，發(fā)現(xiàn)對人工UPEC感染小鼠的腎臟有明顯的保護，但對膀胱的保護不明顯出人意料的是，免疫接種另一

20、種亞鐵血紅素受體ChuA,沒有產(chǎn)生明顯的保護作用雖然鐵攝取系統(tǒng)在UPEC定植上起到關(guān)鍵的作用，但其中必不可少的單-鐵攝取系統(tǒng)還沒有確定。實際上，許多UPEC鐵攝取系統(tǒng)在功能上重登并且表達不均衡，而一個成功的鐵載體受體疫苗需要針對不止一種鐵攝取系統(tǒng)才能獲得更大范圍的功效包含許多外膜鐵受體決定域的多表位疫苗能夠針對數(shù)種UPEC鐵攝取系統(tǒng)產(chǎn)生保護性免疫。近期，Wieser等M構(gòu)建了2種多表位亞單位疫苗Voll和Vol2,包含來自大腸埃希菌的6種外膜鐵受體FyuA、IroN、ChuA、IreA、lutA和Iha以及尿路致病性特異蛋白（Usp）。Voll或Vol2以霍亂毒素為佐劑鼻內(nèi)接種小鼠，在人工腹腔

21、UPEC感染后48h,小鼠肝臟內(nèi)的UPEC載量明顯減少。而接種Vol1（含有FyuA、lutA、Iha和Usp決定域）還能夠明顯減少脾臟中的UPEC細曲載最。多表位疫苗和其他鐵受體的研究成果是令人鼓舞的，而UPEC鐵攝取系統(tǒng)研究有可能是未來UPEC疫苗設計的方向，甚至也可用于其他依靠鐵攝取系統(tǒng)存活的病原體疫苗的研制。八、展望UPEC菌株的特點是異質(zhì)性強，針對單一毒力因子的疫苗不可能對所有UPEC菌株都有效果，而靶向多重毒力因子，例如多種菌毛黏附素或多種鐵受體有可能解決UPEC多樣性這一難題。未來為了設計更科學、更有效的尿路感染疫苗，我們還需要進一步了解UPEC的致病機制及宿主針對感染的黏膜免疫

22、應答。此外，新型的疫苗抗原篩選方法正在幫助發(fā)現(xiàn)以前從未認識到的尿路感染疫苗靶位。Vaxign是一個基于網(wǎng)絡的疫苗設計程序，它通過反向疫苗學預測新的UPEC疫苗靶位齊。除了Vaxign之外，其他的篩選方法也用于尋找新的疫苗靶位，例如Moriel等同以消減反向疫苗學為基礎，通過對3種腸外致病性大腸埃希菌CFT073、536和IHE3034的生物信息分析來預測疫苗抗原。通過這種方法，發(fā)現(xiàn)r230種潛在抗原，其中9種對膿毒癥小鼠模型有保護作用。不論是已進行的疫苗研究，還是新型的疫苗、佐劑及呈遞系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和測試，都使人們對未來研制成功預防尿路感染的疫苗充滿了希望。參考文獻：C1jFoxmanB.Thee

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