1、第六章第六章 卵子和胚胎的冷凍保存技術卵子和胚胎的冷凍保存技術一、卵子和胚胎冷凍保存的意義一、卵子和胚胎冷凍保存的意義 采取特殊的保護措施和降溫程序，使胚胎采取特殊的保護措施和降溫程序，使胚胎或卵母細胞在或卵母細胞在-196下停止代謝，而升溫后下停止代謝，而升溫后又不失去代謝能力的一種長期保存胚胎和卵又不失去代謝能力的一種長期保存胚胎和卵母細胞的技術。母細胞的技術。（一）定義（一）定義1. 建立優良品種的胚胎庫或基因庫，保存動物品建立優良品種的胚胎庫或基因庫，保存動物品種、品系和稀有突變體；種、品系和稀有突變體；2. 運輸胚胎代替活畜的運輸，節省運輸費用和檢運輸胚胎代替活畜的運輸，節省運輸費用

2、和檢疫費用，減少疾病傳播；疫費用，減少疾病傳播；3. 控制品種內的遺傳穩定性和維持某些近交系動控制品種內的遺傳穩定性和維持某些近交系動物的遺傳一致性，節省大量時間和資金；物的遺傳一致性，節省大量時間和資金；凍胚移植還有鮮胚移植所不可比擬的優越性。凍胚移植還有鮮胚移植所不可比擬的優越性。（二）卵子和胚胎冷凍保存的意義（二）卵子和胚胎冷凍保存的意義o19521952年，年，SmithSmith報道用甘油作保護劑，對兔的受報道用甘油作保護劑，對兔的受精卵進行慢速冷凍。但當時無法判定該技術是否精卵進行慢速冷凍。但當時無法判定該技術是否成熟。成熟。o19721972年，年，WhittinghamWhit

3、tingham等首次實現了小鼠胚胎的等首次實現了小鼠胚胎的超低溫冷凍保存，凍胚解凍后移植，產出正常后超低溫冷凍保存，凍胚解凍后移植，產出正常后代。這種方法已廣泛應用于牛、綿羊、山羊、馬、代。這種方法已廣泛應用于牛、綿羊、山羊、馬、家兔、豬等其它哺乳動物的胚胎超低溫保存。家兔、豬等其它哺乳動物的胚胎超低溫保存。二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況o1985年，年， Rall和和Fahy率先將玻璃化冷凍技術應用率先將玻璃化冷凍技術應用于鼠胚胎的冷凍保存。于鼠胚胎的冷凍保存。o所謂所謂玻璃化玻璃化是指利用物理學原理，將高濃度的冷是指利用物理學原理，將高濃度的冷凍保護劑急速

4、降溫后，使其由液態轉化為外形似凍保護劑急速降溫后，使其由液態轉化為外形似玻璃狀的穩定且透明的非晶體化固態，但并沒有玻璃狀的穩定且透明的非晶體化固態，但并沒有改變其在液態時的分子和離子分布。玻璃化可避改變其在液態時的分子和離子分布。玻璃化可避免在細胞內形成冰晶而對細胞產生傷害。免在細胞內形成冰晶而對細胞產生傷害。二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況p冷凍和解凍處理盡管對胚胎有一定的損傷，但將冷凍和解凍處理盡管對胚胎有一定的損傷，但將解凍胚胎在體外培養一段時間后可恢復正常的形解凍胚胎在體外培養一段時間后可恢復正常的形態。目前，牛冷凍胚胎移植后的妊娠率與鮮胚移態。目前，牛

5、冷凍胚胎移植后的妊娠率與鮮胚移植的妊娠率相似。植的妊娠率相似。p卵母細胞體積大，不易充分脫水，故冷凍不易成卵母細胞體積大，不易充分脫水，故冷凍不易成功。功。 二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況oWhittingham（1977）首次成功地冷凍保）首次成功地冷凍保存小鼠卵母細胞以來，人們在此方面進存小鼠卵母細胞以來，人們在此方面進行了大量的研究。玻璃化法冷凍的小鼠行了大量的研究。玻璃化法冷凍的小鼠成熟卵母細胞體外受精及胚胎移植后產成熟卵母細胞體外受精及胚胎移植后產仔率已達仔率已達20%38%。二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況p目前已有

6、關于人、小鼠、牛等卵母細胞冷目前已有關于人、小鼠、牛等卵母細胞冷凍成功的報道，但其成功率較低。凍成功的報道，但其成功率較低。p于永存等（于永存等（2002）報道，用玻璃化法冷凍）報道，用玻璃化法冷凍保存牛保存牛GV期卵母細胞，解凍后其體外成熟期卵母細胞，解凍后其體外成熟率、體外受精率和卵裂率分別為率、體外受精率和卵裂率分別為21.6%、15.1%和和11.1%，顯著高于程序冷凍法和超，顯著高于程序冷凍法和超快速冷凍法的效果。快速冷凍法的效果。二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況二、卵子和胚胎冷凍保存的研究概況三、卵子和胚胎冷凍保存的原理三、卵子和胚胎冷凍保存的原理 當生物細胞在水溶液中冷卻時，細胞

7、和培養液均先處于過冷當生物細胞在水溶液中冷卻時，細胞和培養液均先處于過冷狀態，然后才發生凍結。在大多數情況下，細胞的過冷程度比狀態，然后才發生凍結。在大多數情況下，細胞的過冷程度比周圍溶液更深，細胞外溶液先結冰，使溶質濃縮，導致細胞外周圍溶液更深，細胞外溶液先結冰，使溶質濃縮，導致細胞外環境滲透壓升高。若降溫足夠慢，可通過脫水來維持細胞內外環境滲透壓升高。若降溫足夠慢，可通過脫水來維持細胞內外環境滲透壓平衡；但是降溫過慢，細胞長時間處于高滲環境中環境滲透壓平衡；但是降溫過慢，細胞長時間處于高滲環境中易產生滲透休克；若降溫過快，細胞內水分來不及移到細胞外易產生滲透休克；若降溫過快，細胞內水分來不

8、及移到細胞外而形成冰晶。胞漿內結冰過多會破壞細胞器，刺破細胞膜，導而形成冰晶。胞漿內結冰過多會破壞細胞器，刺破細胞膜，導致細胞死亡。通過凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護劑，致細胞死亡。通過凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護劑，讓細胞在保護劑中平衡并適當脫水，可降低其損傷。讓細胞在保護劑中平衡并適當脫水，可降低其損傷。o一般卵子或胚胎在冷凍過程中不可避免要形一般卵子或胚胎在冷凍過程中不可避免要形成細胞內冰晶，但只要不形成大冰晶，而是成細胞內冰晶，但只要不形成大冰晶，而是維持微晶（冰核）狀態，細胞將不受傷害。維持微晶（冰核）狀態，細胞將不受傷害。o胚胎在冷凍過程中，大約在胚胎在冷凍過程中，大

9、約在-10以上細胞內以上細胞內不結冰，而在不結冰，而在-10以下時，過冷胞質就形成以下時，過冷胞質就形成冰晶。冰晶。三、卵子和胚胎冷凍保存的原理三、卵子和胚胎冷凍保存的原理o冷凍可引起卵母細胞冷凍可引起卵母細胞ZP收縮，破壞細胞骨架，損收縮，破壞細胞骨架，損傷細胞膜和細胞內部結構的完整性，還能損傷細胞傷細胞膜和細胞內部結構的完整性，還能損傷細胞整體，阻礙極體產生，增加整體，阻礙極體產生，增加DNA不穩定性而導致不穩定性而導致染色體異常。染色體異常。o為避免此類現象的發生，一般于為避免此類現象的發生，一般于-7時采用植冰法時采用植冰法及時啟動脫水過程，從而在較高的溫度下誘導形成及時啟動脫水過程，

10、從而在較高的溫度下誘導形成結晶，逐漸擴散至整個溶液，避免冰晶突然形成。結晶，逐漸擴散至整個溶液，避免冰晶突然形成。 三、卵子和胚胎冷凍保存的原理三、卵子和胚胎冷凍保存的原理o胚胎和卵子在冷凍和解凍過程中兩次通過冰晶形胚胎和卵子在冷凍和解凍過程中兩次通過冰晶形成危險區（成危險區（-15-50），采取適當冷凍方法），采取適當冷凍方法和低溫保護劑，使其安全通過危險溫區。和低溫保護劑，使其安全通過危險溫區。o進行冷凍處理前，向保存液中加入保護劑（如甘進行冷凍處理前，向保存液中加入保護劑（如甘油），改變細胞膜滲透性和溶液滲透壓，防止溶油），改變細胞膜滲透性和溶液滲透壓，防止溶液效應和滲透壓差異，減少降溫

11、和復溫過程冰晶液效應和滲透壓差異，減少降溫和復溫過程冰晶的形成。的形成。三、卵子和胚胎冷凍保存的原理三、卵子和胚胎冷凍保存的原理o常規冷凍保存胚胎是在胚胎脫水前誘導結晶，然常規冷凍保存胚胎是在胚胎脫水前誘導結晶，然后緩慢降溫脫水，解凍時快速復溫到常溫。后緩慢降溫脫水，解凍時快速復溫到常溫。o玻璃化法玻璃化法使用的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態物使用的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態物質，低溫時不結晶就可固化。胚胎在此溶液中脫質，低溫時不結晶就可固化。胚胎在此溶液中脫水到一定程度，可引起內源性大分子和已滲入的水到一定程度，可引起內源性大分子和已滲入的保護劑濃縮，從而使細胞在急劇降溫過程中得以保護劑濃縮，從

12、而使細胞在急劇降溫過程中得以保護。保護。三、卵子和胚胎冷凍保存的原理三、卵子和胚胎冷凍保存的原理四、卵子和胚胎的冷凍保存的方法四、卵子和胚胎的冷凍保存的方法（一）抗凍劑的種類（一）抗凍劑的種類1. 低分子滲透型冷凍保護劑低分子滲透型冷凍保護劑甘油（甘油（GL）、二甲基亞砜（）、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇）、丙二醇（PG）、乙二醇（）、乙二醇（EG）、）、1，3丁二醇（丁二醇（BG）、）、甲基溶纖劑（甲基溶纖劑（MC）、乙酰胺（）、乙酰胺（AC）、聚乙二醇）、聚乙二醇（PEG）等。）等。四、卵子和胚胎的冷凍保存的方法四、卵子和胚胎的冷凍保存的方法（一）抗凍劑的種類（一）抗凍劑的種類 抗凍物質

13、一般為小分子物質，在抗凍物質一般為小分子物質，在0以上很容易通以上很容易通過細胞膜進入細胞質。加入保護劑后，細胞內部冰過細胞膜進入細胞質。加入保護劑后，細胞內部冰晶形成溫度顯著降低。此外，保護劑與水分子結合晶形成溫度顯著降低。此外，保護劑與水分子結合形成氫鍵，從而降低凍結部分電解質濃度，減少對形成氫鍵，從而降低凍結部分電解質濃度，減少對細胞的損傷。細胞的損傷。（1）小分子物質）小分子物質 單糖（如葡萄糖），雙糖（如蔗單糖（如葡萄糖），雙糖（如蔗糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖類。糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖類。（2）高分子物質）高分子物質 聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVP

14、）、白蛋）、白蛋白、左旋糖苷、聚乙烯醇（白、左旋糖苷、聚乙烯醇（PVA）、羥乙基淀粉）、羥乙基淀粉和蛋黃等。和蛋黃等。 主要通過改變滲透壓，引起細胞脫水，從而發揮主要通過改變滲透壓，引起細胞脫水，從而發揮非特異性保護作用，又稱為細胞外冷凍保護劑。非特異性保護作用，又稱為細胞外冷凍保護劑。2. 2. 非滲透型冷凍保護劑非滲透型冷凍保護劑o不論是細胞滲透性還是細胞非滲透性的保護劑都主要不論是細胞滲透性還是細胞非滲透性的保護劑都主要是為了給細胞造成脫水狀態，但脫水的同時不能影響是為了給細胞造成脫水狀態，但脫水的同時不能影響到細胞的生存；減少細胞外大冰晶的形成對細胞造成到細胞的生存；減少細胞外大冰晶的

15、形成對細胞造成的損害也是冷凍應注意的方面之一。的損害也是冷凍應注意的方面之一。o業已證實，單純就低溫保存而言，影響細胞冷凍保存業已證實，單純就低溫保存而言，影響細胞冷凍保存的關鍵因素，是細胞冷凍和復溫過程中，必須兩次經的關鍵因素，是細胞冷凍和復溫過程中，必須兩次經過冰晶形成和重結晶的中間損傷溫度區。在冷凍過程過冰晶形成和重結晶的中間損傷溫度區。在冷凍過程中，如果含水量過多，細胞可能毀于過度冰晶形成。中，如果含水量過多，細胞可能毀于過度冰晶形成。但脫水過度，細胞也可能死亡。但脫水過度，細胞也可能死亡。o理想的冷凍方案理想的冷凍方案是：找到細胞含水過多和脫水過是：找到細胞含水過多和脫水過度之間的平

16、衡點；合適劑量的冷凍保護劑，既可度之間的平衡點；合適劑量的冷凍保護劑，既可以取代細胞質膜周圍的水分子，又避免以取代細胞質膜周圍的水分子，又避免“溶質效溶質效應應”；合適的冷凍速率。；合適的冷凍速率。 單一保護劑很難達到胚胎或卵子的冷凍要求。在常單一保護劑很難達到胚胎或卵子的冷凍要求。在常規冷凍方法中，一般選擇一種保護劑（如甘油或乙規冷凍方法中，一般選擇一種保護劑（如甘油或乙二醇）。二醇）。 在快速冷凍和玻璃化冷凍中常采用多種保護劑組成在快速冷凍和玻璃化冷凍中常采用多種保護劑組成的混合保護劑，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、的混合保護劑，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基

17、亞砜等，再輔以丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亞砜等，再輔以糖類。糖類。3.3.混合保護劑混合保護劑低溫保護劑的選擇一般要考慮保護效果、低溫保護劑的選擇一般要考慮保護效果、胚胎毒性和脫除是否容易，要求所用冷凍胚胎毒性和脫除是否容易，要求所用冷凍保護劑的效果好，毒性低且解凍后易于脫保護劑的效果好，毒性低且解凍后易于脫除。除。3.3.混合保護劑混合保護劑Scholander等（等（1957）報道，北極魚可以）報道，北極魚可以在在-18的水中生存，它的血清的凝固點大的水中生存，它的血清的凝固點大約比這一溫度高約比這一溫度高1，從這種動物體內分離，從這種動物體內分離一種抗凍蛋白（一種抗凍蛋白（AFP）。

18、目前，在植物、）。目前，在植物、昆蟲、細菌和真菌都發現并分離出昆蟲、細菌和真菌都發現并分離出AFP。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（AFP）AFP是一種具有特殊功能的蛋白質，在低是一種具有特殊功能的蛋白質，在低溫（溫（4）和超低溫（）和超低溫（-130-168）下，）下，能與細胞膜相互作用而保護細胞，抑制冰能與細胞膜相互作用而保護細胞，抑制冰晶的生長，增強生物體抵御寒冷的能力。晶的生長，增強生物體抵御寒冷的能力。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（AFP） Rubinsky等（等（1992）在冷凍液中加入）在冷凍液中加入AFP，對小，對小鼠鼠2-細胞階段胚胎進行冷凍保存，解凍后囊胚發細胞階段胚胎進行冷凍保存，

19、解凍后囊胚發育率高達育率高達82.5%。 應用魚的應用魚的AFP已經成功地玻璃化冷凍了牛和羊的已經成功地玻璃化冷凍了牛和羊的胚胎及豬的卵細胞。胚胎及豬的卵細胞。 費云標等（費云標等（1995）報道，使用植物）報道，使用植物AFP可提高豬可提高豬胚胎冷凍保存后的成活率。胚胎冷凍保存后的成活率。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（AFP）（二）冷凍保護液（二）冷凍保護液o由基礎液和一定量的冷凍保護劑配制而成。由基礎液和一定量的冷凍保護劑配制而成。o臺氏液、杜氏磷酸鹽緩沖液（臺氏液、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）、）、TCM-199、牛卵泡液、牛卵泡液、Hepes緩沖液或緩沖液或TALP液等。液等。o最常用的是

20、經過改良的最常用的是經過改良的PBS液，即液，即mPBS。使用。使用時通常還加入一定量的同源或異源動物滅活血時通常還加入一定量的同源或異源動物滅活血清或清或BSA。o不同種類和濃度的冷凍保護劑配制成的冷凍不同種類和濃度的冷凍保護劑配制成的冷凍保護液對各種動物胚胎的保護效果不同。即保護液對各種動物胚胎的保護效果不同。即使是同一保護液對同一動物不同來源和不同使是同一保護液對同一動物不同來源和不同發育時期的胚胎保護效果也有差異。發育時期的胚胎保護效果也有差異。（二）冷凍保護液（二）冷凍保護液p此外，用冷凍保護液對胚胎凍前處理的時間、此外，用冷凍保護液對胚胎凍前處理的時間、溫度，平衡的時間和溫度等對也

21、影響其效果。溫度，平衡的時間和溫度等對也影響其效果。p冷凍保護液的配制要求無菌操作，量取選用的冷凍保護液的配制要求無菌操作，量取選用的保護劑和滅活犢牛血清，加入保護劑和滅活犢牛血清，加入PBS在容量瓶中在容量瓶中定容，混合均勻后，用定容，混合均勻后，用G6濾器抽濾滅菌。分裝濾器抽濾滅菌。分裝到到2ml的安瓿中，火焰封口，的安瓿中，火焰封口，4冰箱保存備用。冰箱保存備用。（二）冷凍保護液（二）冷凍保護液o現有保存方法有現有保存方法有4種種常規冷凍法；常規冷凍法；一步冷凍法；一步冷凍法；程序冷凍法程序冷凍法玻璃化冷凍化玻璃化冷凍化 著重講述后兩種著重講述后兩種（三）保護方法（三）保護方法1.常規冷

22、凍法常規冷凍法 也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。o基本步驟基本步驟： 1. 將采集到的胚胎用培養液洗滌后置入有不同冷凍保護劑將采集到的胚胎用培養液洗滌后置入有不同冷凍保護劑（甘油或二甲亞楓（甘油或二甲亞楓（DMSO）等）濃度的三種冷凍液中）等）濃度的三種冷凍液中（冷凍液濃度由低到高，最終濃度（冷凍液濃度由低到高，最終濃度1.4M），每種冷凍液），每種冷凍液中平衡中平衡5分鐘。分鐘。 2. 然后將胚胎和冷凍液裝入細管中封口、標記，放入冷凍然后將胚胎和冷凍液裝入細管中封口、標記，放入冷凍儀中進行冷凍。冷凍速率先以儀中進行冷凍。冷凍速率先以13C分下降至分下降至-6-7，在此

23、溫度誘發結晶，平衡在此溫度誘發結晶，平衡10分鐘。分鐘。1.常規冷凍法常規冷凍法3. 以以0.3分的速率降溫至分的速率降溫至-35- 38，之后投入液氮，之后投入液氮中保存。中保存。4. 胚胎解凍后，需按胚胎進入冷凍液時的相反濃度，即從胚胎解凍后，需按胚胎進入冷凍液時的相反濃度，即從高到低濃度脫除冷凍保護劑，每步高到低濃度脫除冷凍保護劑，每步5分鐘，最后置入含分鐘，最后置入含20血清的血清的PBS保護液中洗滌保護液中洗滌3次，徹底脫除冷凍保護次，徹底脫除冷凍保護劑。或者將解凍后的胚胎放入劑。或者將解凍后的胚胎放入0.5M(或或1.0M)的蔗糖溶的蔗糖溶液中平衡液中平衡10分鐘，再用上述分鐘，再

24、用上述PBS液洗滌液洗滌3次。次。2.一步冷凍法一步冷凍法 也叫一步細管法。o該方法是由慢速冷凍法改進而來，細管內的冷凍液和蔗糖液是分開的，因此，在細管內用蔗糖液可一步脫除甘油抗凍劑，從而利于在生產中推廣應用。3. 程序冷凍法程序冷凍法 也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。o所用冷凍保護劑一般為：所用冷凍保護劑一般為： 二甲亞砜（二甲亞砜（DMSODMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、）、氨基酸、丙三醇（甘油）、1,2-1,2-丙丙二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護劑，對胚胎毒性損二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護劑，對胚胎毒性損害小，解凍后存活率較高。但因其操作繁瑣，降溫速

25、度慢，害小，解凍后存活率較高。但因其操作繁瑣，降溫速度慢，致使所需時間長，需要特殊的降溫裝置，在不具備實驗條致使所需時間長，需要特殊的降溫裝置，在不具備實驗條件的場所不能使用此法進行胚胎冷凍。件的場所不能使用此法進行胚胎冷凍。p影響因素影響因素包括：抗凍保護劑的選擇與濃度、植冰和降溫速包括：抗凍保護劑的選擇與濃度、植冰和降溫速度、解凍方法、抗凍的脫出等。度、解凍方法、抗凍的脫出等。o將采集到的胚胎在含將采集到的胚胎在含20%小牛血清的小牛血清的PBS溶液中洗滌溶液中洗滌2次次o講洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含講洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol|L甘油和甘油和20%小小牛血清的牛血清的

26、PBS的冷凍中平衡的冷凍中平衡20mino將胚胎和冷凍液裝入將胚胎和冷凍液裝入0.25ml胚胎冷凍細管中，封口，并在胚胎冷凍細管中，封口，并在細管外標記供體號、胚胎數量、等級、冷凍日期等細管外標記供體號、胚胎數量、等級、冷凍日期等o將裝入胚胎的習慣放入冷凍儀中，在將裝入胚胎的習慣放入冷凍儀中，在0平衡平衡10min，以，以1|min的速度降至的速度降至-7-6，并在此溫度下誘發潔凈，平衡，并在此溫度下誘發潔凈，平衡10min，然后，然后0.3的速度降溫至的速度降溫至-38-35，投入液氮保存。，投入液氮保存。基本步驟：基本步驟：3. 程序冷凍法程序冷凍法o解凍時從冷凍液中取出裝胚胎的細管，在空氣中平解凍時從冷凍液中取出裝胚胎的細管，在空氣中平衡衡10s10s，立即至于，立即至于3737水浴解凍，水浴解凍，1min1min后取出完成后取出完成解凍過程。解凍過程。o將細管中的冷凍液及胚胎推出，在現實鏡下找到胚將細管中的冷凍液及胚胎推出，在現實鏡下找到胚胎并移入解凍液。采用三步法脫除甘油，每步胎并移入解凍液。采用三步法脫除甘油，每步5-5-7min7min。最后用。最后用PBSPBS液將胚胎洗液將胚胎洗3-53-5遍，供移植備用。遍，供移植備用。基本步驟：基本步驟：3. 程序冷凍法程序冷凍法4.玻璃化冷凍法玻璃化