1、螞蝗抗凝血酶活性物質提取工藝改進(1)    【摘要】  目的通過正交實驗研究中藥水蛭中抗凝血酶活性物質提取的最佳工藝。方法采用正交實驗設計法，以提取溫度，生理鹽水用量，提取次數和提取時間為考察因素，每個因素設計3個水平進行實驗。以測得的水蛭素含量和蛋白質含量計算出水蛭素的比活力做為評價指標進行正交實驗。結果最佳提取工藝為：15倍溶劑量，溫度為70，提取時間為30 min，提取次數為兩次。結論該方法可為中藥水蛭中抗凝血酶活性物質的提取提供依據。 【關鍵詞】  水蛭素; 蛋白質; 正交實驗; 提取工藝水蛭是傳統的破血逐瘀藥，始載于神農本

2、草經，中國藥典2005年版收載了水蛭Hirudo nipponica Whitman，螞蝗Whitmania pigra Whitman和柳葉螞蝗W.acranulata Whitman 3種1。水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面有著很強的生物活性，其中水蛭素是迄今為止發現的最強的凝血酶抑制劑之一。在中國水蛭臨床用藥多為炮制品，其炮制方法多樣，質量各異，標準不一。經過調查，市售的炮制品水蛭多為開水燙制水蛭(清水水蛭)和滑石粉炒制水蛭，然而隨著研究的不斷深入，越來越多的學者認為生用效果更佳2，所以本實驗采用風干的生水蛭也就是吊干水蛭進行研究。正交實驗設計可以用較少的、有代表性的處理組合數提供充分有用

3、的信息，與普通的多因素試驗設計相比，它在分析主效應與交互作用的同時大大減少了樣本量及實驗次數，是一種高效、靈活的多因素試驗設計方法，因此被廣泛應用于科學研究中。目前對水蛭抗凝血活性物質提取的報道特別是對提取工藝研究的報道較少，為了有效地開發和利用藥材資源，充分提取水蛭中抗凝血活性成分，本實驗采用正交實驗的方法對傳統提取方法進行了改進，確定了生理鹽水提取水蛭中抗凝血酶活性成分的最佳提取工藝，為水蛭資源的開發和抗凝血物質的提取提供科學依據。1 儀器與材料1.1 儀器FA2004型電子天平(萬分之一，上海恒平儀器有限公司)，TGL-16M型高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)，HHZ-4型恒溫

4、水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)，微量移液器(DRAGON-MED)，Spe-54型雙光束紫外分光光度計(上海棱光技術有限公司)。1.2 材料水蛭藥材購于河北安國中藥材市場(經佳木斯大學藥學院生藥學教研室劉娟教授鑒定為螞蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全體)。1.3 試劑凝血酶(Thrombin，蘇州新寶制藥有限公司，規格：500 IU，批號：H32020891);(牛)纖維蛋白原(Fibrinogen，SIGMA，F8630-200mg，凝固物含量為75%);牛血清白蛋白(BSA，SIGMA，A730-5g，98%);Tris堿、鹽酸、生理鹽水、硫酸銅、酒石酸鉀鈉均為國

5、產分析純。2 方法與結果2.1 溶液的制備根據相關文獻資料和預試驗3，取水蛭干燥全體用銼刀銼成細粉，稱取水蛭細粉9份，每份2.0 g。以生理鹽水為提取溶劑，以提取次數、提取溫度()、提取時間(min)和提取溶劑倍量為考察因素，每個因素選擇3個水平，以測得的水蛭素的含量和蛋白質的含量計算得出的水蛭素比活力作為考察指標。選用L9(34)正交表進行實驗，對中藥水蛭中水蛭素的提取工藝進行研究，并對結果進行方差分析和顯著性檢驗。各因素及水平見表1，正交實驗設計方案及結果見表2。2.2 水蛭素活力的測定 精密量取提取液上清液100 l，置試管(20 mm×10 mm)中，加入含0.5%牛纖維蛋白

6、原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液200 l，搖勻，置37水浴中預溫2 min。緩緩滴加20 IU·ml-1的凝血酶溶液(每1 min不超過5 l，也就是0.1 IU的凝血酶)，邊滴加邊輕輕搖勻，至出現絲狀凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積。按下式計算抗凝血酶活性(U):U=20(IU·ml-1)×V(ml)×W/0.1(ml)。其中，V為消耗凝血酶溶液的體積，W為提取液總量4。2.3 蛋白質含量測定本篇論文由網友投稿，讀書人只給大家提供一個交流平臺，請大家參考，如有版權問題請聯系我們盡快處理。2.4 水蛭素比活力的計算根據所測得的水蛭素活性與蛋

7、白質含量就可以計算出水蛭素的比活力，計算公式為：水蛭素比活力(ATU·mg-1)=水蛭素總量(ATU)/蛋白質總含量(mg)。表1 因素水平2.5 實驗結果以水蛭素含量和蛋白質含量來計算水蛭素比活力為綜合評價指標，采用SPSS13.0數據處理系統進行方差分析。由表2可知因素C的極差最小，也就是對本試驗的影響最小，所以以此項為誤差項進行方差分析。結果見表3。根據正交實驗結果、直觀分析及方差分析結果可見各因素對水蛭素得率影響的順序為：A>B>D>C。由表3可知，A和B兩項因素的P值小于0.05，對實驗結果影響顯著，因素D的P值大于0.05，說明因素D對實驗因素影響不顯著

8、。因此因素A和B為主要因素，D和C因素為次要因素。因此，本實驗的最佳的提取工藝為：A3B3D2C2，即在70，15倍劑量的條件下提取兩次，每次30 min為最佳的提取工藝。表2 L9(34) 正交實驗方案及結果3 討論通過本實驗的研究表明，合理地利用正交實驗不僅省時、省力，還可以達到很好的實驗效果。使用SPSS統計軟件包對L9(34)正交實驗結果進行數據處理，只要按正交表的設計格式輸人實驗數據，便可獲得所需的統計結果。其操作方便、直觀、快捷，結果準確。此法也可用來處理其他正交實驗的數據。表3 方差分析結果以往的文獻報道多以提取物總氮提取率、水蛭素含量或抗凝血作用作為提取工藝篩選的考察指標，但往往都是不夠全面或敏感性太低。為此，本實驗以測得的水蛭素含量結合水蛭提取液中蛋白質的含量計算出水蛭素的比活力作為考察指標對提取工藝進行了優化。結果表明，在70下，以15倍劑量的生理鹽水分兩次提取，每次30 min可獲得較好的提取效果。【參考文獻】  1 國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學工業出版社，2005：57.2 劉麗芳，金蓉鸞，徐國鈞，等.中藥水蛭經炮制后成分