1、流式細胞術的新應用楊麗娜 學號201011560摘要：流式細胞術是目前生物學領域重要的檢測技術，它是一項集多種高科技技術于一體的新型分析檢測方法。近年來在其基礎上建立起來的新型流式細胞儀系統，在生物研究領域有著廣泛的應用。本文綜述了近五年流式細胞術在新領域的應用和進展。關鍵詞：流式細胞術；進展；應用流式細胞術是上個世紀六七十年代發展起來的一門高新技術，它集成了計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫等多項技術和方法，兼具有分析和分選等功能。流式細胞術通過檢測細胞的熒光強度或其他光學特性可分辨多種細胞特性，如細胞表面標志物、蛋白表達、DNA含量、細胞內離子濃度、細胞內氧化還原狀態、細胞

2、功能如細胞凋亡、細胞周期和磷酸化狀態等1，其在臨床診斷、疫苗研發、基因組、蛋白組、蛋白工程、新藥發現、生殖生物學、植物和海洋生物學、毒理學、單分子檢測等多方面發揮著舉足輕重的作用2。至今流式細胞儀經過40多年發展，在檢測技術、高通量分析、數據收集與分析等方面都取得了很多突破，如成像流式細胞儀，將流式細胞檢測與熒光顯微鏡成像結合，不僅獲得細胞群的統計數據，同時可得到單個細胞的圖像，從而提供細胞形態、細胞結構和亞細胞信號分布、細胞相互作用、胞內分子轉運、基因表達分析等信息；生物分選流式儀，可以對各種生物微粒和生物大分子進行分選和測定；高通量流式分析儀可以進行多重蛋白或可溶性化合物的高通量篩選和分析

3、；功能性流式細胞儀，則可以進行細胞功能的分析和研究，如細胞凋亡及細胞周期分析等。近年來隨著技術的不斷創新和方法的改進，流式細胞術在生物學領域的應用范圍日益擴大。本文結合近年來的研究，就其在生物領域的新應用做一概述。流式細胞術的基本原理是根據每一個微粒（細胞）的熒光強度和光散射情況等屬性的不同進行檢測，從而將細胞或微粒按大小、形態或其他特性的不同進行分辨，近年來流式細胞術在以下幾方面的生物研究中的取得了一定的突破和進展。1.單細胞分析流式細胞術最初用于分析細胞的熒光強度及分選帶有特定熒光標記的細胞。將細胞懸浮于液流中單排通過多激光光束，從而使激光探測器將細胞發出的熒光信號轉換為電信號，通常細胞被

4、細胞膜蛋白的熒光抗體所標記。根據不同波長下光信號的強度，將細胞以大小，粒度和膜蛋白的表達量的不同而逐個進行區分。流式細胞儀和細胞分選器可每小時分析上千個單細胞，并且可同時分析多達18個蛋白標記3。此外流式細胞術還可用于純化亞細胞群3。在過去幾年中，流式細胞術逐漸發展，現已可用于鑒定和純化各種各樣的細胞群，包括組織和腫瘤中的干細胞4。近來的進展包括利用磷酸化特異性抗體檢測多種蛋白的磷酸化狀態，從而監控成千個單細胞的信號通路3。而將流式細胞術和質譜分析法結合后，用特異性的多原子標簽替代熒光標簽來標記抗體，可克服不同熒光標簽產生的光疊加問題，從而增加標記物的檢測數量，實現多參數檢測3。2 基因組測序

5、與基因表達的檢測流式細胞術可分離單個細菌從而進行全基因組擴增和測序5，最近發現可從腫瘤細胞中分離單個流式分選的核，接著進行全基因組擴增和單細胞基因的測序，從而研究腫瘤發展6。而另一個課題組發現通過FISH并結合流式細胞術可對染色體上的重復基因組進行分析7。流式細胞術與FISH的結合也可用于端粒平均長度的檢測8。在基因的甲基化分析中，流式細胞儀可用于尋找癌癥的生物標志物，通過定量臨床血漿和糞便樣品中DNA甲基化狀態可尋找生物標志物9。流式細胞儀目前不僅僅用于基因組研究，還可通過標記DNA進行染色體倍性分析、細胞周期分析、分揀染色體。最新研究發現它還可用于篩選精確分期的線蟲胚胎，從而分析其RNA表

6、達10，而通過反復交配和單缺失株的富集可創建出帶有多個精確缺失的釀酒酵母11。3.高通量篩選流式細胞術因其多參數、高速分析和高分選能力，加之新型流式細胞儀整合了96孔板上樣技術和數字化電子系統，使得樣品采集速度高達15000個/秒，尤其適用于高通量篩選。近來流式細胞術用于從可溶性化合物文庫中篩選藥物，并且在藥物研發的其他階段發揮著重要的應用，如化合物定性，通路分析，毒理學等1。目前已成功通過流式細胞術高通量篩選單鏈抗體12，也可用于篩選新藥13如抗凋亡Bcl-2蛋白家族的抑制劑的高通量篩選14，G蛋白信號調節蛋白RGS4D抑制劑的鑒定15，轉運蛋白ABCB1，ABCC1和ABCG2的特異性抑制

7、劑的檢測16。利用高通量流式細胞術還可篩選和分析蛋白酶活性17。4.臨床應用流式細胞術每秒成千個樣品的檢測能力，為生物醫學與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段，尤其是在診斷機體免疫狀態或腫瘤形成時，在基礎研究中可通過分析磷酸化蛋白從而評估信號通路，在應用中可檢測藥物處理后動物或病人體內細胞功能的改變，因此流式細胞術在臨床和預臨床研究中也很受歡迎1。流式細胞術可進行淋巴細胞亞群分析，將不同的淋巴細胞亞群區分開，并可計算它們相互間的比例。通過對患者淋巴細胞各亞群數量的測定了解淋巴細胞的分化功能，鑒別新的淋巴細胞亞群，并且通過研究大多數疾病的特異性淋巴細胞亞群或某些細胞表面標志的存在、缺乏、過度表達

8、等，對一些疾病，如免疫學疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監測等有重要的意義。如HIV主要侵襲CD4陽性細胞，而導致CD4陽性T細胞減少，為艾滋病的診斷和治療提供依據。流式細胞術在臨床上也可用于白細胞亞型分析，還可用于利用靶向特異性抗原的抗體可鑒定血細胞的亞群，從而得出病人的免疫表型特性 1。在臨床診斷中，由于可用探針及儀器設備的限制，多參數流式細胞術未能普及，但隨著多激光流式細胞儀和新型探針（半導體納米晶體，量子點）的研發，流式細胞術可分析17種熒光散射光18, 19，但由于進樣、程序設置及數據分析等的復雜程度依然限制了流式細胞術在監控臨床試驗中的作用，但優化檢測流程

9、后可讓使用流式細胞儀監控的多中心臨床試驗的實驗可變性降至最低程度20，從而擴大流式細胞術在臨床中應用范圍。展望流式細胞術整合了激光光學、現代流體力學、電子物理學、光電測量技術、計算機技術、熒光化學技術及單克隆抗體技術等多項技術，是多學科多領域技術進步的結晶。隨著現代科技的發展，流式細胞術仍然在快速發展，并已在檢測技術、分選技術及高通量分析等方面得到了廣泛應用。隨著現代生物醫學、精密機械加工技術的發展，以及新型熒光染料的開發和細胞制備方法的改進，流式細胞術也必將取得更大更快的進展，得到更加廣泛的應用。參考文獻 1Sklar L A, Carter M B, Edwards B S. Flow c

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