1、偽狂犬病基因缺失疫苗的研究進展碼爍(南京農業大學動物醫學院.江蘇南京210095)摘要:偽狂犬病(PR)是一種可引起多種家畜以發熱、奇庠及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病，是嚴重危害我國及世界其他各國養豬業的主要疫病之一。疫苗免疫接種是有效防治和根除偽狂犬病的根本措施。此文就偽狂犬病主要的毒力基因.以及不同的基因缺失苗的特性進行了綜述，并對今后的發展進行了展望。關鍵伺:偽狂犬病病毒；基因缺失苗;研究進展偽狂犬病(pseudorabics,PR),又稱Aiyeszky氏病，是由胞痊病毒科a-皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型又稱為偽狂犬病病春(PseudorabiesVirus,PRV)所引起的豬、牛、羊等多

2、種家布、家禽和野生動物的一種以發熱、奇癢(除豬外)及腦怦場炎為主癥的-種急性傳染病。豬站該病齦主要的傳染源，對養豬業造成的經濟損失僅次于豬瘟和口路疫.我國自1947年首次報道以來.現己蔓延到24個省(自治區、直轄市),造成了巨大的經濟損失.疫苗免疫接種是預防和控制乃至根除偽狂犬病的根本措施.早期的疫苗大多為*5毒苗和天活苗，但姑弱毒苗存在著標力返強和畋養的危險.而滅活苗免疫效率較低，免疫時用最較大，有時可導致注射部位腫脹，出現過敏反應.隨者分子生物學技術的發展，基因缺失疫苗由于能較為有效地激發體液和細胞免疫，因此成為各國對偽狂犬病的研究中必不可少的研究內容.1PRV基因歌失苗的相關基礎研究偽狂

3、犬病茬基因缺失疫苗的研制始于20世紀80年代初期，利用基因工程技術在PRV基因組中插入或缺失-段序列致使PRV的某些基因不能&達，從而致弱PRV,同時又保持其較強的免疫原性.PRV基因缺失主妻包括：對與盤力相關基因如TK、gE、gl等造成缺失以降低病毒毒力.或對摭皆白如gG、gC.gD等基因造成映失以引入選擇標記或阻止感染性病毒產生.研制生產高效可靠的基因缺失疫苗首先就要對主要毒力基因的功能特點進行深入研究.1.1 TK基因的功能特性TK基因.又稱胸昔激IW(thymdinekinase,TK)基因，是決定PRV毒力最主妾的毒力基因，其主要作用是催化脫氧胸腺嗟度核昔硝酸化成dTMP,并進一步磷

4、酸化為dTTP,即成為組成DNA分子的基本成分；此外也間接參與推進dCTP、dGTP.dATP等物質的合成.TK基因與病勝在機體中長期保持潛伏感染和在神經組織中的增殖.以及激活潛伏感染狀態的病毒粒子等過程密切相關，但與病毒在細胞中的增玳無關.TK基因的缺失不僅會引起PRV扇力鹿失或極顯著地降低，同時也可使其在神經組織中的復制能力、從外周神經到腦的傳播能力和引起腦炎致死的能力大大降低.同時TK基因缺失后的毒株同野毒株一樣在培養細胞上增殖良好，但能力和潛伏感染的能力大大降低.1.2 gE基因的功能特性gE基因是PRV的-種糖蛋白基因，它編碼的gE糖米白在體內和體外復制生長中地非必需的，但決定了毒力

5、和病卷岌制.另外，gE基因促進PRV通過突觸相連的神經元，從而促進其進入中樞神經系統(CNS)和在其中轉運擴敞.因此，gE基因對于PRV的毒力是:很阪要的,但PRV的毒力是受多基因控制的.單獨發生gE基因映失的疫苗株往往保留相當程度的毒力。1.3 gl基因的功能特性gl基因同樣編碼-種精蛋白.gl基因對病毒在細胞中的增殖是作必需的，但對病卷的體外培芥仍有影響.在多種細胞系中，gl基因的映失可能會影響病催從細胞中的釋放。此外，gl基因還可誘導細胞瞅合，促進病魅在細胞間的擴散，PRVgl基因缺失株在多種細胞中形成的空斑僅為肝版株產生的空斑大小的85%.在病律侵染過程中，不僅促進病春在神經系統中的復

6、制，而且還能促進或協同其他精蚩白在毒力、神經晴性等方面發揮作用.當gl基因、gC基因單獨峽央時.能力有所下降.但gC基因、gl基因雙缺失的收組病扉的雇力幾乎完全水失，當gl單基因缺央時，病成也可侵染一、二級神經元，而當gD基因、gl基因同時缺失時.雙缺失病嵌在初級神經元的夏制受到制約。1.4 gD基因的功能特性gD基因在病毒基因組中的兩大功能是介導病推進入細胞和編碼PRV主要中和抗原景白。舔失gD基因的健株及失了感染能力，即gD賀白參與病毒穿透過程，與病柢進入靶細胞有關，但對病卷在細胞間的傳播并非必需.同時，gD基因編碼的gD糖蛋白也是PRV主妻的免疫原性蛋白之一，它刺激機體產生的抗gD糖蛋白

7、的抗體具有中和保護能力。2偽狂犬基因缺失疫苗的構建方法PRV基因缺失疫苗可分為天然基因缺失疫苗、人工傳代致弱的基因缺失疫苗和使用基因工程技術去除特定的和毒力有關的基因或基因片段而獲得的缺失疫苗3種,而目前所稱的“基因缺失疫苗”主要是指最后一種。隨著人們對PRV分子生物學的研究不斷深入，PRV中冬基因的功能逐漸清楚，可以有目的地對基因序列進行改造，從而構建甦安全有效的基因缺失苗。目而，偽狂犬基因缺失疫苗的構建有3種方法：同源敢組法、煎登克隆文庫法、細菌人工染色體法。3偽狂犬病基因缺失苗的種類3.1偽狂犬病毒單基因缺失苗TK基因缺失疫苗由Kit等干1985年以PPVBUK株為起始材料，通過缺失TK

8、基因序列的148bp而獲得，它對鼠和免的春力大為減退，并能引起鼠、兔和豬的堅強保護力，抵抗PRV強毒的攻擊，強柩排出時間減少.1986年該毒株被美國批準為上市的第I個基因工程疫苗。TK基因缺失株經生物學和動物試驗證明其對Balb/c小白鼠有較高的安全性，接種豬能產生很強的免疫力并能抵抗PRV強毒的攻擊，但是，僅缺失TK基因的弱毒株對犢牛還有較低的毒力，對狗、貓的毒力更強.現在的基因工程苗均以TK基因缺失為基礎制成。3.1.1 gD基因缺失疫苗由Peeters等于1994年構建而成。當動物接種表型互補的PRVgD-突變株時，病毒能纏直接在細胞和細胞間轉移，但是感染細胞釋放的子代病毒無感染性，缺失

9、gD基因的毒株將失去從免疫動物向非免疫動物傳染的能力，因此是一種高度安全的疫苗候選毒株，對接種豬能產生明顯的保護性，證明gD缺失突變株是一種安全、不散毒的活疫苗，也可作為安全表達異源基因產物的活載體疫苗。3.1.2 RR基因缺失疫苗DeWind等(1993)報道了RR缺失的毒株對小鼠和豬的毒力下降,編碼RR大單位的UL39基因滅活后，在口鼻弒液中排卷量低，雖然誘生的抗體低，但可保護強毒攻毒后豬不出現臨床癥狀.所以RR突變株有望成為新型疫苗的候選者，此外RR突變株還可作為進入神經細胞的基因莪體.RR前在體外可被一種作用于小亞單位C末端的多肽特異性抑制，為研究抗ADV藥物提供模型.3.1.3 PK

10、基因缺失疫苗Kimman等于1994年證明US3-缺失株對豬的毒力明顯降低.與gE基因缺夾株比較.PK缺失株在毒力下降方面與其相似，但免疫原性下降不如gE基因缺失株。此外，PK-技失株在體內外的增殖滴度很低，但不影響共免疫原性，PK不包含保護性抗原決定簇，其激醵活性對免疫保護也不楚必需的。PK基因缺失病毒對兔子、小白鼠和仔豬的毒力大大降低，在測定攻毒保護率的實驗中，證明重組病毒免疫豬己經產生了對偽狂犬病病毒的保護，與油苗的效果相當.3.1.4 dUTPase基因5失疫苗dUTPase基因由UL50編碼。Jons等1996年將報告基因LacZ插入PRVKa株構建了UL50-缺失株。對病毒在細胞上

11、的繁殖影響不大，但毒力下降，用它免疫能能保護豬抵抗致死St的強毒攻擊，可作為新的基因工程疫苗候選毒株。3.1.5 gM基因缺失疫苗由Dijkstra等于1997年構建而成。gM蛋白由UL10編碼，是PRV的一個非必需糖蛋白.用它原內免疫接種6周齡豬，能夠保護豬抵抗強毒的攻擊。3.2偽狂犬病毒雙基因缺失苗偽狂犬病毒雙幕因缺關疫苗是在TK基因缺失疫苗的基礎上發展起來的，它比僅布TK也基因缺失的疫苗更優越。由于TK基因屬于酶蛋白基因，在體內不能產生共相應的抗體，若要用血清學方法區別開免疫接種豬與自然感染豬，就必須缺失相應的糖蛋白基因。據此，偽狂犬病盤雙基因缺失疫苗株除了在TK基因引入1個缺失外，在編

12、碼非必需械賀白的幕因內引入1個新的缺失，或插入1個報告基因，這樣得到的突變株就不能產生被造成缺失的精蛋白，因而免疫動物就不能產生相應的抗體，從而可以通過血清學方法將免疫接種豬與自然感染野卷豬相區別，同時某些糖蛋白的缺失也可進一步降低其毒力.這些為雙基因缺失疫苗的特點.3.2.1 TK-/gC雙基因缺失苗該疫苗株是由Kit等于1987年為克服TK單基因缺關的不足，在PRVBUK-dl3株的基礎上，通過缺失gC基因序列的1100bp,構建出的缺失了TK、gC基因的PRVTK/gC疫苗株.動物實驗表明，用該缺失疫苗接種的動物不能產生抗gC的抗體，用gC-ELISA可將接種動物與自然感染動物區分開，有

13、利于檢疫工作的開展.值得一提的是，核基因缺失疫苗株還不能產生gE的抗體，因此，gE-ELISA也可以作為區分接種動物和自然感染動物的一個標志。怛這種基因缺失苗產生的中和杭體不高，在除日本外的其他國家很少使用.3.2.2 TK-/gG雙基因缺失苗Marchioli等于1987年利用一株碘脫氧尿昔抗性突變株HR(TK)作為親本構建了TK/gG雙基因缺失株。該基因缺失株TK基因缺失276bp,gG基因也被造成缺失。用PRVTK/gG-制備的疫苗接種動物，結果表明對小鼠、豬、綿羊無毒性，對牛有中等卷豬群保健IIEALTII性，對犬、貓有較強的毒性，小鼠、豬被免疫接種后，能抵抗強毒的攻擊,結合gGELI

14、SA可以區分疫苗接種動物與野毒感染動物。這種基因缺失苗在美國批準使用，但其應用首先還要:解決血清學鑒別診斷的敏感性問題.3.2.3TKVgE-雙基因缺失苗1987年和1990年，Quint和VanOirschot等分別利用NIA-3和NIA-4做親本，構建了TK/gE雙基因映失株并建立了血清學鑒別診斷方法gE-ELISA。該疫苗對豬、牛、羊均安全，不產生潛伏感染，用它接種的豬能抵抗PRV強毒的攻擊。因不表達抗gE蛋白的抗體.同樣也可用gEELISA將疫苗接種動物與自然感染動物相區別。3.3偽狂犬病毒多基因缺失苗TK-/gE/gI-/LacZ+基因缺失苗2003年，華中農業大學陳煥春等將質粒pF

15、BBS與EcoRI線性化的PRV鄂A株（SA株）TK/gE/LacZf突變株基因組DNA共轉染IBRS-2細胞，經過空斑篩選獲得。該基因缺失株遺傳穩定，不會返強。將其接種于仔豬、育肥豬、妊娠母豬，扶得了明顯的免疫效果，可用gE-ELISA進行檢測。疫苗接種小鼠、家兔等動物在試驗期內均未出現精神異常或死亡現象，表明該疫苗具有極高的生物安全性，適用于偽狂犬期的防制。3.3.1 gG-/gE-/gI-/gC-4基因缺失疫苗1990年，Mettenleiter等構建了gG/gE/glVgC4基因映失株,它對6周齡仔豬完全無毒，免疫接種仍使豬獲得對強靡攻擊的保護。3.3.2 gG-/gE-/gI-/gD-4基因缺失疫苗】994年，Mettenleiter等利用已整合PRVgD的細胞系，構建了gG/gE-/gI/gD4基因映失疫苗，這種疫苗不會散毒，非常安全，對豬失去毒性，能剌激機體產生對PRV的保護性免疫。4小結與傳統的滅活苗和弱毒苗相比，基因缺失疫苗具有明顯的優越性。首先，基因缺失突變株只有突變性狀明確、穩定的優點。第二，PRV缺失株毒力低，但免疫原性強，保護力好.第三，不易侵入中樞神經系統夏制或侵入能力大大減弱.第四，疫苗免疫動物與自然感染動物可以密別診斷。但是，堆因缺失疫苗在引起潛伏感染