1、血清脂類測定血漿中的脂類包括膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，對有關(guān)脂類代謝疾患的診斷和治療過程，均必須檢測血漿（清）中的脂類，通過其含量的變化，對臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關(guān)醫(yī)學(xué)科研工作，脂類的定量檢測也是一項(xiàng)必備的研究項(xiàng)目。1膽固醇測定血漿中膽固醇及其酯的含量檢測，從方法學(xué)上可分為兩大類：一類是化學(xué)法包括抽提法和直接測定法，這類方法目前仍在沿用；另一類是酶法測定，方法敏感特異快速，并能自動化分析，已常規(guī)應(yīng)用。化學(xué)測定法種類多，由于顯色反應(yīng)的特異性不同，其結(jié)果有一定的差異。目前公認(rèn)的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應(yīng))法。另外，三氯化鐵-硫酸反應(yīng)法（Z

2、ak法）具有顯色穩(wěn)定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應(yīng)法，膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是特異性差，干擾因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清樣品中的血紅蛋白，膽紅素以及硫酸的質(zhì)量等因素均可影響Zak方法的準(zhǔn)確性，Zak法更適合于科研使用。酶法測定血清膽固醇的方法已被廣泛采用，國產(chǎn)試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測定用的標(biāo)準(zhǔn)品，按美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS）出品純度達(dá)99.8%,是國際公認(rèn)的參考物，國內(nèi)李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨床檢測血清膽固醇使用。2甘油三酯測定血漿甘油三酯的測定，目前多以化學(xué)法和酶法定量。化學(xué)法測定甘油三酯是以脂蛋白變性，水解

3、成甘油，并以甘油為計(jì)算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再測定甘油，方法特異，準(zhǔn)確而快速，臨床廣為應(yīng)用。目前甘油三酯測定的方法主要以定量甘油為依據(jù)，然而血清樣品中存在有游離甘油，如何從反應(yīng)過程中的總甘油中減去游離甘油，多年來一直在研究討論這一問題。若不減去，其測定值將會高于血清樣品中的真值，如果要減去，就必須先測出血清樣品中的游離甘油，甘油三酯的測定方法將增加一個繁雜的步驟，實(shí)際工作中難以做到。有報(bào)道血清樣品中的游離甘油實(shí)際量是0.070.13mmol/L，相當(dāng)于甘油三酯的0.56.0mmol/L，為此建議，實(shí)測的甘油三酯量減去一個校正系數(shù)即：甘油三酯（mmol/L）=0.98&#

4、215;總甘油（mmol/L）-0.07（mmol/L）。這一校正系數(shù)也僅適用于健康人，對臨床病人并不一定適用。據(jù)報(bào)道，血清樣品的游離甘油一直是個未知數(shù)，無法測準(zhǔn)。為此，目前臨床測定血清甘油三酯時，基本上未考慮游離甘油，因?yàn)槠浜亢苌伲瑫呵液雎圆挥洝８视腿y定的參考物，推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此參考物適用于化學(xué)法。在酶法測定中，仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。3磷脂測定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經(jīng)磷脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測各種磷脂，可以通過薄層層析法、柱層析法和高壓液相色譜法。目前，臨床僅測定血清磷脂總量。血清磷脂總量的測定方法有化

5、學(xué)方法和酶法兩大類。化學(xué)法是以磷脂中的磷為定量依據(jù)，因?yàn)槊苛字肿又卸己幸粋€磷酸根，故將磷脂的磷稱為脂性磷。由于血清中磷脂大部分為卵磷脂，其分子量中磷約占4%，故將脂性磷換算成磷脂的系數(shù)，一般為25。由于化學(xué)法均需要抽提，再測抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸鹽不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸鹽對磷脂測定的干擾很少。酶法是利用磷脂酶進(jìn)行定量測定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四種。磷脂酶D特異性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂，三者約占血清總磷脂的95%，臨床多用含磷脂酶d 的試劑進(jìn)行磷脂的定量測定。4游離脂肪酸測定游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸，故又稱為非酯化脂肪酸

6、，其量很少，采用方法必須是靈敏的方法，還需要避免脂肪水解產(chǎn)生脂肪酸的干擾。測定方法有：滴定法需要微量滴定裝置，因?yàn)橐ㄟ^肉眼觀察顏色，難免會有主觀因素的影響，所以難以測定準(zhǔn)確，很難用于常規(guī)；光度法，以銅皂法常用；酶法，主要采用特異性不強(qiáng)的脂肪酶D進(jìn)行檢測，方法特異，快速準(zhǔn)確，已常規(guī)應(yīng)用于臨床。第一節(jié)膽固醇測定血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分別結(jié)合亞油酸（43%）、油酸（24%）、軟脂酸（10%）、亞麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最

7、少。血清總膽固醇測定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。1化學(xué)法化學(xué)法一般包括：抽提；皂化；毛地黃皂苷沉淀純化；顯色比色四個階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了、。或者用省去、步驟的Zak-Henly法及省去步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用。2酵法測定CE在膽固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再經(jīng)膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。

8、該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確，標(biāo)本用量少，便于自動生化分析儀作批量測定。 一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氫氧化鉀，使膽固醇從脂蛋白中分離出來，同時使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖、抽提，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層，蒸發(fā)至干，再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)，620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量。2試劑組成代號種類濃度組成貯存28有效時間R1乙醇優(yōu)質(zhì)純R2石油醚沸點(diǎn)68，特級純R3水醋酸分析純R4無水醋酸膽固醇分析用，不含HCIR5濃硫酸分析純R6KOH液33%(W/W)

9、KOH10g+H2O20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml臨用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420體積+R51體積+R310體積1h試劑*內(nèi)用完R9膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1100ml0*：在三角燒瓶內(nèi)，加入無水醋酸，于冰水中冷至10以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置10min，又加冰醋酸混勻，備用。3操作圖15-1 血清膽固醇（Abell法）測定操作圖按圖15-1操作。4計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L) 二、酶法（CEH、COD-POD法）首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶（

10、CEH）水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）作用下，生成4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經(jīng)過氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）參與下，生成紅色醌亞胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林紅色醌亞胺色素（一）手工測定法1試劑組成代號種類濃度組成貯28有效時間Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L膽酸鈉3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCa

11、rbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2標(biāo)準(zhǔn)液5.17mmol/L用異丙醇溶解膽固醇*混勻，調(diào)pH至6.70±0.10(25)，或購買試劑盒。酶以活性單位表示。2操作按圖15-2操作。3計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)（二）自動化分析儀測定以CL-7200型全自動生化分析儀檢測為例。1試劑組成A液：CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。圖15-2 血清膽固醇測定（酶法）操作圖2上機(jī)參數(shù)項(xiàng)目參數(shù)方法終點(diǎn)法波長雙波長（540nm，700nm）反應(yīng)溫度37試劑A

12、反應(yīng)時間23min試劑B反應(yīng)時間56min樣本用量3l試劑A用量250l試劑B用量120l單位mmol/L3操作過程4計(jì)算以A=A2-A1，根據(jù)同樣處理之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，打印結(jié)果。5注意事項(xiàng)（1）試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。（2）試劑在有效內(nèi)28避光食保存。（3）膽固醇含量超過200mmol/L，需用生理鹽水稀釋再測。第二節(jié)甘油三酯測定甘油三酯又稱中性脂肪，由于其甘油骨架上分別結(jié)合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸，相應(yīng)稱為甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）和甘油一酯（MG）。血清中90%95%是TG，TG中結(jié)合的脂肪酸分別為油酸（44%）、軟脂酸（26%）、亞油酸（16

13、%）和棕櫚油酸（7%）。血清TG測定方法一般分為物理化學(xué)法、化學(xué)法及酶法三大類。血清中TG的化學(xué)組成并不單一，準(zhǔn)確求其分子較為困難。因標(biāo)準(zhǔn)不同，測定結(jié)果存在差異。化學(xué)法多采用三棕櫚精（軟脂精）（分子量807.3）、三油精（分子量895.4）為標(biāo)準(zhǔn)，按摩爾濃度計(jì)算。酶法測定以三油精為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行換算。1化學(xué)法化學(xué)測定法包括：TG的抽提分離；皂化；甘油糖的氧化；氧化生成甲掌顯色定量等四個階段。操作較為繁雜，影響測定因素太多，本法準(zhǔn)確性差，一般很少用。2酶法測定酶法測定包括：TG的抽提與皂化；加水分解生成甘油糖定量等二個階段。目前常規(guī)檢測應(yīng)用的方法有甘油激酶（glycerolkinase,GK）法和甘

14、油氧化酶（glycerol Oxidase,GOD）法。操作簡便，快速準(zhǔn)確，并能在自動化生化分析儀上進(jìn)行批量測定。 一、乙酰丙酮法1原理血清中加入異丙醇抽提取甘油三酯，經(jīng)KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在過碘酸作用下氧化成甲醛，在氯離子存在下甲醛與乙酰丙酮縮合生成黃色的3，5二乙酰，1，4二氫甲基吡啶，其顏色的深淺與甘油三酯的含量成正比，420nm測定定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞TG的提取測定。2試劑組成代號種類濃度組成貯2-8有效時間R1抽提液（CH3）CHOH（A.R）重蒸餾R2吸附劑氧化鋁，水洗除去微細(xì)顆粒， 110烤干3h以上閉封一周R3皂化劑5%KOH

15、 5g+H2O100mlR4醋酸溶液2mol/LCH3COOH 11.5ml+H2O100mlR5過碘酸鈉0.05mol/LNaIO4 1.07g+H2O100mlR6氧化劑R4 1體積+R51體積一周R7醋酸銨液CH3COONH2 15.4g+H2O100mlR8顯色劑CH3COCH2COCH30.75ml+R-140ml+R-7 100ml+R-4 80mlR9參考液2mg/dl三油酸甘油酯 2mg+R-1100ml（TG100mg/dl）3操作按圖15-3操作。圖15-3 血清甘油三酯（乙酯丙酮法）測定操作圖4計(jì)算血清TG濃度=ESA/EST×1.13(mmol/L) 

16、;二、酶法（GK-GPO-POD比色法）血清中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，爾后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羥丙酮并生成H2O2，H2O2與底物4-氨基安替比林和ESPAS在過氧化物酶（POD）作用下，生成紅色亞醌化合物（quinoneimine），比色（500nm），其顏色深淺與甘油三酯含量成正比。（一）手工測定法1試劑組成代號種類濃度貯存28R1磷酸甘油氧化酶3.0KU/L冷藏（A液）抗壞血酸氧化酶1.0KU/L甘油激酶0.7KU/L4-氨基安替比林80mg/LR2脂蛋白脂酶2.0KU/L冷藏過氧化物酶10KU/

17、LESPAS300mg/LR3（參考液）甘油酸三脂200mg/dl（2.26mmol/L）冷藏*：一般采用商品試劑盒圖15-4 血清甘油三酯測定法（酶法）操作圖2操作按圖15-4操作。3計(jì)算血清TG濃度=ESA/EST×2.26(mmol/L)（二）生化分析儀檢測全自動生化分析儀測定操作（以CL-7200型為例）。1試劑A液：GK，GPO，4-AA-P、抗壞血酸氧化酶等。B液：POD，Lipase,ESPAS等。標(biāo)準(zhǔn)液：甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。2上機(jī)參數(shù)名稱參數(shù)方法終點(diǎn)法波長雙波長（540nm 700nm）試劑A反應(yīng)時間23min試劑B反應(yīng)時間56mi

18、n反應(yīng)溫度37樣本用量4l試劑A用量200l試劑B用量100l單位mmol/L3操作過程4計(jì)算以A=A2-A1并根據(jù)同樣之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算，自動打印結(jié)果。5注意事項(xiàng)試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。試劑在有效期內(nèi)28避光保存。樣本中甘油三酯含量超過11mmol/L需用生理鹽水稀釋后再測。第三節(jié)磷脂測定磷脂（PL）并非單一的化合物，其分子內(nèi)含有磷酸基的多種脂質(zhì)，磷脂是這一類物質(zhì)的總稱。血中PL包括：卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%10%；磷脂酰乙醇胺等，占2%；鞘磷脂，占20%。血清PL定量方法包括測定無機(jī)磷的化學(xué)法和酶法兩大類。1化學(xué)測定法過程包括：抽提分離；灰化；顯色、比色的三個階段。

19、2酶測定法可分別利用磷脂酶A、B、C、D等4種酶作用，加水分解，測定其產(chǎn)物，對PL進(jìn)行定量。一般多采用磷脂酶D（PL-D）進(jìn)行定量。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含膽堿的磷脂，這三種磷脂約占血清總磷脂的95%。本法快速準(zhǔn)確，便于自動生化分析儀器進(jìn)行批量檢測。 一、化學(xué)法（消化法）1原理以有機(jī)混合試劑（無水乙醇、乙醇）抽提血清中磷脂，再用濃硫酸和過氯酸消化抽提液中的脂類和其他有機(jī)化合物，用硝酸鹽與磷反應(yīng)生成有色化合物，比色定量。本法可用組織細(xì)胞磷脂的抽提定量。2試劑組成代號種類濃度組成貯28有效時間R-1抽提液無水乙醇：乙醇=3:1R-2消化液用1L密器，加水約50

20、0ml，置冷水中緩緩加濃硫酸280ml到水中，冷卻后加過氯酸（70%，AR）65ml，混勻，加蒸餾水至1000mlR-3顯色劑鉬酸銨（A.R）2.5g+無水醋酸鈉8.2g，加蒸餾水溶解并稀釋至1L，監(jiān)用時取此液體9份加新配的VitC液（10%）1份，混合即可R-4參考液（貯存液）1mg/L稱干燥KH2PO（A.R）0.4393g,溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至100ml的容量中，用蒸餾水加至刻度。冷藏R-5參考應(yīng)用液0.04mg/ml取貯存液2ml加至50ml容量中，加水至刻度冷藏3操作按圖15-5操作。4計(jì)算血清脂性磷濃度=ESA/EST×10(mg/dl)血清磷脂（以卵磷脂計(jì)）=ESA/E

21、ST×10×0.3229(mmol/L)圖15-5 血清磷脂測定（消化法）操作圖*采用帶塞玻璃試管 二、酶法1原理磷脂酶D因特異性不高，能水解血清中卵磷脂，溶血卵磷脂和神經(jīng)磷脂（三者占血清總磷脂的95%），釋放出膽堿，膽堿在膽堿氧化酶作用下生成甜菜堿和H2O2，在過氧化物酶作用下，H2O2，4-氨基安替比林、酚發(fā)生反應(yīng)生成紅色醌亞胺化合物，其顏色深淺與這三種磷脂的含量成正比，在500nm波長下比色計(jì)算結(jié)果為：2試劑（1）酶應(yīng)用液（參考配方）：每100mlTris-His緩沖液（50mmol/L，pH7.8）中含：磷脂酶D45U膽堿氧化酶100U過氧化物酶220U4

22、-氨基安替比林12mg酚20mgCaCl2·2H2O8mgTritonX-1000.2g(2)標(biāo)準(zhǔn)液：純卵磷脂，臨用前配制，5mg/2.5ml蒸餾水（含TritonX-1000.5%）3操作（1）標(biāo)本采集：空腹12h抽靜脈血，不抗凝，分離血清或抗凝血分離血漿。（2）在3.0ml酶應(yīng)用液中加入血清（漿）20l，標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)液20l，空白管加水20l，放置37水浴10min后，波長500nm，比色，空白管液調(diào)零。4計(jì)算血清磷脂（mg/dl）=TA/SA×200血清磷脂（mmol/L）=血清磷脂（mg/dl）×0.01292第四節(jié)非酯化脂肪酸測定臨床上將C10以上的脂肪

23、酸稱為游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W9）占54%，軟脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外還有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。與其他脂質(zhì)比較，NFFA在血中濃度很低，其含量水平極易受脂代謝，糖代謝和內(nèi)分泌機(jī)能等因素影響，血中NFFA半壽期為12min，極短。血清中的NFFA是與清蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸，屬于一種極簡單的脂蛋白。測定血清NFFA法有滴定法。比色法，

24、原子分光光度法，高壓液相層析法和酶法等。一般多以酶法測定。作NFFA測定的標(biāo)本一定要注意在4條件下分離血清并盡快進(jìn)行測定。因?yàn)檠杏懈鞣N脂肪酶存在，極易也極快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。貯存標(biāo)本僅限于24h內(nèi)，若保存三天，其值約升高30%，使結(jié)果不準(zhǔn)確。1非酶法測定非酶法測定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高壓液相層析法。前三種方法準(zhǔn)確性差；高壓液相層析法，儀器太昂貴，不便于批量操作。2酶測定法主要用脂肪酶測定。血清中游離脂肪酸可分別測定酶水解后的產(chǎn)物乙酰CoA或AMP或輔酶A（CoA）進(jìn)行定量。酶法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，快速，易于批量檢測。測定原理如圖15-6所示。圖15-6 血清主要FFA酶法測定圖：內(nèi)物質(zhì)作為生成量與變化量進(jìn)行測定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶；PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脫氫酶。 一、亮度法1原理血清中游離脂肪酸經(jīng)抽提到高密度銅試劑中，形成銅皂在上層溶劑中，再用二苯卡巴肼與銅顯色，進(jìn)行定量。2試劑組成代號種類濃度組