1、香菇多糖的提取純化方法呂紅常秀蓮*某某大學生命科學院，某某264005摘要：香菇多糖是香菇中別離出的一種重要的具有生理活性的物質，具有抗病毒、抗腫瘤、 增強人體免疫力等多種功能，在保健食品和藥品開發(fā)方面具有廣闊的應用前景。概括介紹當前常用的熱水浸提法、酶解法、微波提取法和深層發(fā)酵培養(yǎng)法等6種香菇多糖的提取方法。并簡單比擬香菇多糖提取的這幾種方法并介紹了超濾-滲濾法和活性炭聯(lián)合陶瓷膜超濾法這兩種香菇多糖的純化方法。關鍵詞：香菇多糖；提取；純化；抗癌;抗病毒Extract on and purificati on of LentinanLvh ong cha ngxiulia n*(Ya ntai

2、 uni versity life academy of scie nces, Yan tai 26005)Abstract: Lentinan was isolated from mushrooms with an importa nt physiological activity of substances with anti-virus, anti-cancer, enhance immunity and other functions. It has broad application prospect s in health food and drug' s deveopoe

3、nview of the currentformulati on used in hot water, en zymatic method, microwave extract ion and deep ferme ntati on method 6 kinds of mushroom polysaccharides method, And In troduced theUltrafiltratio n-filtratio n method and the Activated carb on ceramic membra ne joi nt ultrafiltration method of

4、Lentinan purification.Keywords: Mushroom polysaccharide ;Separation ; cancer ;antiviral1引言香菇多糖(Lentinan)是一種3-1,3-葡聚糖,是從擔子菌綱傘菌科真菌香菇子實體中提取別 離純化獲得的均一組分的多糖，能治療癌癥，抗惡性腫瘤，抗病毒，抗感染，提高人體免疫力等多種生理功能。目前國內對香菇多糖的別離有了很大開展，主要采用的方法有傳統(tǒng)熱水提取法、酸提取法、堿提取法、這些方法都有其優(yōu)點，也有其難以克制的不足之處。與傳統(tǒng)方 法相比微波輔助提取法具有設備簡單，快速，高效，安全等特點。2香菇多糖的提取方法2

5、.1熱水浸提法這是最早采用的一種傳統(tǒng)方法：香菇多糖溶于水，熱水浸提時，香菇組織細胞膨脹破裂，多糖成分浸出。熱水浸提香菇多糖，浸提時的料液比、溫度、時間、pH、醇析時的乙醇添加倍數(shù)與提取次數(shù)是影響多糖得率的主要因素。對料液比而言，假如加水太少，提取不徹底；加水太多，容易降低提取液的固形物含量， 不利于以后的別離，且加重了工業(yè)生產(chǎn)中的后續(xù)工藝，一般為1 : 20左右。對溫度來說，隨著提取溫度的升高，粗多糖得率逐漸升高，在80% 一 95%時達到頂峰，再提高溫度時，粗多糖得率升高趨勢趨于平緩，考慮到高溫會破壞多糖的結構，影響其生物活性，同時高溫提取對工業(yè)化生產(chǎn)的設備要求更嚴格。所以，提取溫度一般以8

6、0C 95C為宜。隨著提取時間的延長，粗多糖得率逐漸增加，0.5h 一 3h之間趨勢明顯，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率加趨勢逐漸趨于平緩，一般浸提時間為8h一 12h。熱水浸提時的pH為自然pH值，大約在6-8之間。而對醇析時提取液的乙醇濃度來說，隨著其逐漸升高，多糖得率亦逐 漸增加，但乙醇濃度達到 75%后再繼續(xù)添加乙醇，對粗多糖得率的影響不大，所以提取液的 乙醇濃度最好不超過75% 。當然，提取次數(shù)對多糖得率也有一定的影響，多糖得率隨著提取次數(shù)的增加而增加，但提取次數(shù)超過2次后，多糖得率增加緩慢， 趨于平緩。我們通常可以確定2次提取為比擬適宜 的提取次數(shù)1。總的來說，熱水浸提法的最優(yōu)提取條件

7、由具體的實驗環(huán)境而定，一般可根據(jù)正交實驗確定。應注意幾點： 浸提過程必須充分，這是前提。浸提后過濾時應盡量趁熱過濾，否如此溫度降低，物質問的黏度增大，過濾時間增長。（3）濃縮過程受儀器影響較大。一般旋轉蒸發(fā)儀是一種較好的濃縮裝置。2. 2稀酸（堿）浸提法從香菇中提取多糖的提取劑有：酸液、堿液、酶與熱水等，提取劑為酸（堿）時，即所謂的酸（堿）提取法。該法提取香菇多糖也受多方面因素的影響：酸（堿）溶液的濃度、作用時間等。一般情況下，0.4mol/L的HC1溶液在40 C 60CX圍內，多糖得率較高2。需注意， 香菇多糖的提取應防止在強酸、強堿溶液中進展，否如此極易造成香菇多糖中糖苷鍵斷裂與構象變化

8、而形成較多單糖，影響多糖得率，因此香菇多糖較少采用此法提取。2.3酶解法香菇細胞壁主要由纖維素、果膠等組成，細胞膜主要由蛋白質和磷脂組成，因此我們可以用具有專一性和高效性的酶，如纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等來提取香菇多糖。近年來有報道用鏈霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶與胰蛋白酶等處理后，再經(jīng)透析能得到根本無蛋白質與小分子雜質的香菇多糖。酶解法就是指在浸提的過程中參加相應的酶來水解纖維素、果膠、蛋白質分子等，以使多糖從細胞中別離出來。 此環(huán)節(jié)影響多糖得率的主要因素有：酶用量、酶作用時間、作用溫度和pH。酶的用量太少，不能徹底水解香菇細胞壁中的纖維素、果膠和細胞膜中的蛋白質，從 而不能使多糖從細胞

9、里更好的別離出來，降低多糖得率；酶太多，多糖量增加趨勢趨于平緩，而造成原料的浪費酶制劑的作用時間也要適宜，過短，酶不能充分水解纖維素、果膠、蛋白質等，使得多糖得率降低；過長，多糖的量不會繼續(xù)增加，同時浪費時間，造成生產(chǎn)上的不 必要浪費。當單因素考慮時，一般我們認為， 纖維素酶的最適反響濃度為 0.5% ,最適反響 時間為80min，最適反響溫度為 50 C 一 60 C，最適pH為5.0;果膠酶的最適反響濃度為 0.5%，最適反響時問為 80min，最適反響溫度為 35 C一 45 C，最適pH為4.5 ;木瓜蛋白 酶的最適反響濃度為 1.0%，最適反響時間為 60min，最適反響溫度為 50

10、C一 60C，最適 pH 為 4.5。眾所周知，溫度和pH值會極大的影響酶的活性，高溫、過酸、過堿，都會使酶失去活 性，這些都不利于酶活性的發(fā)揮。因此，具體的環(huán)境，我們應該通過實驗找出最適酶用量， 作用時間，溫度和pH值，這樣不僅能達到香菇多糖的最大得率，而且省時，經(jīng)濟。除以上因素外，酶的類別和向預處理液參加不同酶的先后順序也會影響香菇多糖的得 率。香菇細胞壁具有全透性，小分子物質如水、乙醇等與大分子物質如多糖、蛋白質等能自由出入；細胞膜具有半透性，只允許小分子物質通過。當細胞壁被水解后，細胞膜在一定條件下通過滲透吸水破裂，細胞內多糖等物質流出。同時，環(huán)境因素如pH、溫度等也可使細胞膜破裂。當

11、用蛋白酶提取香菇多糖時，蛋白酶透過細胞壁， 與細胞膜接觸，水解膜蛋白從而破壞膜結構，香菇多糖得以析出；當用纖維素酶處理時，在適宜條件下，細胞壁被水解，同時細胞膜由于吸水或外環(huán)境因素的影響而破裂，多糖類物質流出。一般情況下，用復合酶提取效果明顯高于單酶的提取，這是因為香菇細胞壁主要由蛋白質、幾丁質和纖維素等構成，很鞏固；使用纖維素酶，果膠酶和蛋白酶先后水解，共同作用 于香菇的細胞壁，使其破裂，多糖易于從胞內釋放，比單一酶作用提高了香菇多糖的得率。 但是，假如蛋白酶和纖維酶同時使用，由于各自的最適條件不同，不能達到最優(yōu)水解效果， 同時蛋白酶對纖維素酶具有水解作用，所以有些文獻報道雙酶水解與用纖維素

12、酶單酶水解相比，效果沒有明顯提高。X寧和李健纖維素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分別兩兩組合成復合酶，研究其提取效果，結果如表1:表1復合酶提取香菇多糖復合酶纖維素酶+木瓜蛋白酶纖維素酶+中性 蛋白酶木瓜蛋白酶+纖維素酶中性蛋白酶+纖維素酶多糖得率%由此可知，木瓜蛋白酶的提取得率明顯高于纖維素酶和中性蛋白酶的得率，其中尤以纖 維素酶+木瓜蛋白酶處理效果最優(yōu)。木瓜蛋白酶也是目前所知道的一種十分適合香菇多糖提 取的酶，這是因為它有特殊結構：它是一種含疏基(-SH)肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力。因此，復合酶解法是一種較好的提取法，很

13、有開展前景。在具體提取多糖時，應注意不同酶的選擇與組合，同時結合相關環(huán)境條件，篩選制定出最優(yōu)提取方案。2.4微波法提取香菇多糖微波提取法是一種新型提取法，由于溶劑與細胞液吸收微波能，微波射線輻射于溶劑并 透過細胞壁內部時，細胞內部溫度升高壓力增大，當壓力超過細胞的承受能力時，細胞壁破裂，位于細胞內部的多糖就從細胞中釋放出來4。在微波法提取多糖的實驗中，影響多糖提取率的主要因素有：微波功率、提取時間以與提取次數(shù)等。隨著微波功率的提高，加熱速度增大，分子運動速度加快，滲透、擴散與溶解 速度加快；同時，高功率的微波引起細胞內部的結構變化，加速香姑多糖由外層細胞轉移到溶液中。所以，隨著提取功率的升高香

14、菇多糖的得率升高，當功率超過40%時，多糖增加趨勢趨于平緩；當功率達到 60%左右時，多糖局部會被碳化。所以，微波功率一般為700W至900W。對微波作用時間而言，隨著時間的延長，多糖得率先上升，而后又下降。這可能是因為微波輻射時間加長， 香菇多糖慢慢分解， 逐漸被氧化而造成多糖的損失。因此，微波作用時 間也很重要，應根據(jù)所用微波功率和處理的樣品量來決定適當?shù)淖饔脮r間。而微波提取的次數(shù)也會對其產(chǎn)率有一定的影響。 隨著次數(shù)的增多，多糖得率增加，但到了一定程度后，變化 不大，考慮到提取次數(shù)增多，工藝操作復雜，水溶劑用量增加，過濾和濃縮困難，因此，提 取次數(shù)不宜過多，通常為 2至3次5。2.5超聲波

15、提取法香菇多糖的超聲波(20KHz-50MHz)提取一利用超聲波的空化作用分散破壞植物組織，加速植物多糖成分的浸出提取；另外超聲波產(chǎn)生的機械振動、孚L化和擊碎效應等也能加速多糖 成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，提高香菇多糖的得率。另外，超聲波破碎過程是一個物理過程，浸提過程中無化學反響發(fā)生，浸提的多糖的結構和性質不會發(fā)生變化。所以用超聲波提取香菇多糖可大大地縮短提取時間，減少料液比和降低提取液的粘度，而提取液粘度的降低有利于超濾別離時降低濃差極化的影響，從而提高多糖得率。超聲波提取香菇多糖應注意超聲時間、超聲溫度、超聲功率的選擇：一般超聲時間為 20-40min，超聲溫度為65C 70C，而最

16、優(yōu)超聲功率為 80W左右。目前，超聲波逐漸被廣泛應用于天然產(chǎn)物的提取，如超聲波提取中草藥有效成分如皂甙類、生物堿、黃酮類成份等。2.6深層發(fā)酵培養(yǎng)提取法%左右。因此在工業(yè)生產(chǎn)中，此法很具競爭優(yōu)勢。其發(fā)酵工藝與主要提取過程：香菇保藏菌種t斜面母鐘t搖瓶菌種t種子罐培養(yǎng)液t發(fā)酵液t上清液胞外多糖）、菌絲體胞內多糖多糖的后續(xù)提取工藝同一般方法，只是胞外多糖提取時， 其濃縮液要進展透析處理，其他各步驟根本一樣 。總之，該法生產(chǎn)周期大為縮短，在市場競爭中占據(jù)很大優(yōu)勢，符合現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)方式。 香菇發(fā)酵較細菌，放線菌，酵母菌發(fā)酵時間長，極易感染雜菌，因此，工藝全過程的無菌控 制是深層發(fā)酵培養(yǎng)成敗的關鍵。3香

17、菇多糖的別離純化近年來采用超濾法（7）提取香菇多糖，可以降低本錢，提高產(chǎn)率，但產(chǎn)品純度較低。超濾-滲濾法可改善產(chǎn)品純度充分發(fā)揮膜別離技術的優(yōu)勢。在30 C, 0.3 MPa壓力差下，用截留相對分子質量為50000的濾膜對香菇多糖提取液進展超濾滲濾純化，用 Sevag法除去濃縮液中的蛋白質，然后冷凍枯燥，得到多糖制品。%，收率為1.59% ,而超濾純化所得產(chǎn)品純度僅為74.4%。超濾-滲濾純化法與超濾純化法相比，純度提高了 8.1%，這是因為滲濾時濃縮液中的小分子糖類能夠充分通過濾膜， 提高了制品的純度。超濾-滲濾是一種有效的純化香菇多糖的方法。3.2活性炭聯(lián)合陶瓷膜超濾純化香菇多糖超濾純化所得

18、產(chǎn)品純度可達 74.4% ,超濾-滲濾法所得多糖制品的純度提高到80.4%,但實踐證明有機膜始終存在著不能解決膜污染、不能抗高壓和高溫等問題。活性炭聯(lián)合陶瓷膜超濾法先用活性炭預處理，再用陶瓷膜超濾法進展純化精制。 采用適宜孔徑的無機陶瓷膜超濾來純化香菇多糖既表現(xiàn)了超濾無相變、無溶劑污染、容易保持生物分子的活性、操作簡單可靠等優(yōu)點，又可彌補有機膜的諸多缺點。以45 %的香菇多糖粗品為研究對象，用1%活性炭對香菇多糖粗品預處理后，采用截留分子量為50000的陶瓷膜超濾。超濾條件為溫度 40 C、跨膜壓差0.20MPa、膜面流速4.5m/ s。 在此條件下，多糖粗品脫色率達98.12 % ,蛋白質脫除率為81.10 %，多糖純度從45 %提高到 89.17 %，收率為 77.16 %。4.結論通