1、KiSS 1基因重組真核質粒的構建、鑒定及其表達 作者：徐玫芳 臧盛兵 黃愛民 劉景豐 高凌云 高美欽【摘要】 目的 構建KiSS1基因重組真核質粒，將其導入人高轉移肝癌MHCC97H細胞中，獲得瞬時表達的細胞株，為進一步研究KiSS1基因對人肝癌細胞侵襲轉移的影響奠定基礎。 方法 Trizol試劑法提取新鮮胎盤組織總RNA，經RTPCR擴增目的片段，PCR產物及真核表達載體分別雙酶切后進行連接，并轉化入大腸桿菌Ecoli.Dh5擴增以獲得重組載體，采用脂質體介導轉染技術將高純度的KiSS1質粒轉染到人高轉移肝癌細胞株中，用RTPCR和Western blot技術加以鑒定。 結果 RTPCR獲

2、得預期大小的特異性DNA片段，經PCR、雙酶切鑒定及測序，證實已將KiSS1基因cDNA片段正確插入真核表達載體中;RTPCR、免疫細胞化學和Western blot證實KiSS1基因已轉染入MHCC97H細胞中。 結論 成功獲得pcDNA3.1/HisC/KiSS1重組質粒和瞬時表達KiSS1基因的肝癌細胞，為后續建立穩定轉染的KiSS1高表達陽性細胞克隆奠定基礎，為體內外實驗研究KiSS1對人肝癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響提供前提條件。 【關鍵詞】 腫瘤抑制蛋白類 遺傳載體 轉染 肝腫瘤 腫瘤侵潤 真核細胞核 質粒肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我

3、國常見的惡性腫瘤之一，居男性惡性腫瘤第3位，病死率高，為惡性腫瘤的第二死因1。HCC易發生早期侵襲轉移，是患者術后高復發乃至死亡的主要原因。KiSS1作為一個腫瘤轉移抑制基因，在很多腫瘤的侵襲轉移過程中起重要作用23，但在與肝癌關系的研究中，國內外部分學者發現其與腫瘤轉移抑制作用存在相悖45。因此深入研究KiSS1基因的表達與HCC侵襲、轉移及預后的關系很有必要。為此，筆者利用基因克隆技術構建了真核表達載體pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并將其導入人高轉移HCC MHCC97H細胞中，獲得瞬時表達的細胞株，為后續建立穩定轉染的KiSS1高表達陽性細胞克隆奠定基礎,為體內外實驗研究KiS

4、S1對人HCC細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響提供前提條件。1 材料與方法1.1 材料 新鮮胎盤組織來源于福建醫科大學附屬第一醫院婦產科正常分娩的胎盤;大腸桿菌Ecoli.Dh5、真核表達載體pcDNA3.1/HisC由福建醫科大學分子醫學生物中心惠贈;Trizol試劑及脂質體Lipofectamine 2000為美國Invitrogen公司產品;RTPCR逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶(Xho I, BamH I)、T4 DNA連接酶為美國Fermentas公司產品;質粒大量抽提試劑盒為北京Tiangen公司產品;兔抗人KiSS1為美國Santacruz公司產品;Elivis

5、ion plus二抗試劑盒為福州邁新生物技術開發公司產品;細胞裂解液為美國Pierce公司產品;PCR引物：根據Gene Bank中查到的KiSS1的mRNA序列，用軟件Primer Premier 5.0設計上下游引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(劃線部分分別是BamH I和Xho I的堿基識別序列，斜體部分為保護序列)：上游：5CCAGGATCCATGAACTCACTGGTTTCTTGG3下游：5AGACTCGAGTCACTGCCCCGCACCTG31.2 方法1.2.1 重組真核質粒的構建與鑒定1.2.1.1 RTPCR擴增目的片段KiSS1基因 取50 mg冷凍的新鮮胎盤

6、組織Trizol試劑法提取總RNA，經紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性;所得RNA用Fermentas逆轉錄試劑盒將其逆轉為cDNA，并將其通過PCR法進行擴增，產物行凝膠電泳，目的片段按膠回收試劑盒說明書行膠回收純化，-20 保存。1.2.1.2 KiSS1和真核表達載體pcDNA3.1/HisC的酶切與連接 0.2 mL離心管中依次加入BamH I 1 L、Xho I 2 L、Buffer BamH I 2 L及KiSS1 DNA 15 L，37 水浴過夜，加入6上樣緩沖夜4 L進行瓊脂糖凝膠電泳，將酶切的產物膠回收。BamH I、Xho I雙酶切質粒p

7、cDNA3.1/HisC，步驟同上。將上述回收產物加入如下反應體系：10連接緩沖液2 L，T4 DNA連接酶1 L，雙酶切KiSS1 9 L，雙酶切pcDNA3.1/HisC 8 L，終體積20 L，4 連接過夜。取上述連接產物10 L轉化至150 L感受態大腸桿菌Ecoli.Dh5中，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37 培養1620 h，形成單菌落。隨機挑選23個菌落分別接種于LB液體培養基2 mL中(含氨芐青霉素2 L)，37 搖床250 r/min振蕩過夜。1.2.1.3 陽性重組子的鑒定 (1)PCR鑒定重組質粒。取1 L上述振搖擴增過夜的菌液，PCR法進行擴增，產物行1.0%瓊脂糖

8、凝膠電泳檢測。(2)雙酶切鑒定重組質粒。將PCR鑒定陽性的克隆進行搖菌擴增，按質粒抽提試劑盒說明書抽提質粒。質粒進行BamH I、Xho I雙酶切鑒定，步驟同KiSS1雙酶切，產物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)目的片段的測序鑒定。如經上述鑒定均證實目的片段已連入載體中，則取陽性克隆菌液100 L，交上海生工生物工程公司測序鑒定。1.2.2 脂質體介導的細胞轉染 轉染前1 d將處于對數生長期的MHCC97H細胞以每孔3105的密度接種于6孔培養板。轉染當天，細胞達60%80%融合。將重組pcDNA3.1/HisC/KiSS1和pcDNA3.1/HisC質粒轉染入人HCC細胞，分別命名為轉染

9、組(MHC/KiSS1)和空載體組(MHC/pcDNA3.1);未轉染的MHCC97H細胞命名為未轉染組。未轉染組和空載體組分別設為空白對照組和陰性對照組。采用脂質體Lipofectamine 2000介導基因轉染，據說明書操作。轉染6 h后更換含15%胎牛血清的生長培養基，于37 、體積分數為0.05的CO2環境中繼續培養至轉染后48 h。1.2.3 轉染結果的鑒定1.2.3.1 RTPCR法檢測mRNA Trizol法分別對3組細胞進行總RNA抽提，獲得符合逆轉錄要求的RNA;Fermentas二步法進行RTPCR反應(方法如前述)，產物于-20 保存。1.2.3.2 免疫細胞化學法檢測K

10、iSS1蛋白的表達 常規細胞爬片，脂質體介導細胞轉染。轉染后48 h，取出爬上細胞的蓋波片，PBS沖洗2次，95%乙醇固定20 min，蒸餾水沖去殘留乙醇，采用Elivision plus二步法，據試劑說明書操作，一抗KiSS1工作濃度為1100，以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染。1.2.3.3 Western blot檢測KiSS1蛋白表達 3組細胞經細胞裂解液裂解提取總蛋白。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。各組樣本分別取總蛋白300 g,經16.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后半干式轉PVDF膜，室溫封閉5 h。與特異性的一抗4 孵育過夜，與二抗(辣根過氧化物酶標記)室溫孵育2 h后

11、，化學發光法顯影，以actin作為內參照，觀察3組細胞的KiSS1蛋白表達情況。2 結 果2.1 胎盤組織總RNA完整性鑒定及純度和濃度測定 提取的胎盤組織總RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示清晰的28 S和18 S兩條RNA帶，說明提取的總RNA的完整性良好。對RNA樣品進行紫外分光光度分析，顯示提取的RNA無蛋白質和DNA污染(D260/D280為1.85)，濃度(2 091.9 ng/L)符合逆轉錄的要求。2.2 從胎盤組織擴增出的KiSS1基因進行凝膠電泳 PCR擴增出目的片段(包含酶切位點和保護堿基)，瓊脂糖凝膠電泳顯示約456 bp的DNA片段，片段的大小與預期結果一致(圖

12、1)。2.3 重組質粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1的PCR和雙酶切鑒定 經PCR鑒定，擴增出約438 bp的目的片段，片段的大小與預期結果相符，初步表明目的片段連接上重組載體;經雙酶切鑒定，產生重組質粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1中約5.5 kb的空載體和插入的約438 bp的目的DNA，進一步證實了重組體大小與預期結果一致，成功獲得了重組真核表達載體pcDNA3.1/HisC/KiSS1(圖2)。2.4 重組質粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1的測序鑒定 經上海生工生物工程公司的序列測定分析，KiSS1的序列與Gene Bank中KiSS1 cDNA的序列完全一致(

13、圖3)。 1：marker;2：目的質粒KiSS1 PCR;3：目的質粒酶切;4：目的質粒;5：空質粒酶切;6：空質粒.2.5 RTPCR法檢測細胞的mRNA水平 轉染后48 h，RTPCR法檢測KiSS1 mRNA在3組細胞中的表達情況，電泳結果顯示，3個泳道GAPDH mRNA條帶的亮度相似，而KiSS1 mRNA條帶只有轉染組細胞出現，未轉染組細胞和空載體組細胞均未出現，說明轉染組MHC/KiSS1細胞mRNA水平上有表達KiSS1基因(圖4)。2.6 免疫細胞化學法檢測KiSS1在細胞中的表達 爬片細胞的免疫細胞化學染色結果顯示，未轉染MHCC97H細胞和MHC/pcDNA3.1細胞中

14、未見KiSS1陽性信號，而在實驗組MHC/KiSS1細胞中KiSS1呈陽性表達，陽性產物定位于細胞質中，表明轉染后48 h，轉染組MHC/KiSS1細胞高效表達KiSS1蛋白(圖5)。2.7 Western blot檢測KiSS1在細胞中的表達 3組細胞均可檢測到分子量約43 kD的內參蛋白actin的表達，但只有轉染組細胞中有相對分子量15.4 kD的KiSS1蛋白的表達，而未轉染組細胞和空載體組細胞中未檢測到此蛋白。上述結果表明，轉染48 h后，轉染組MHC/KiSS1細胞高效表達KiSS1蛋白(圖6)。3 討 論盡管通過外科手術切除、肝動脈栓塞、放射治療和全身化療等治療措施，HCC得到一

15、定程度的遏制，但腫瘤的侵襲和轉移仍長期困擾患者，成為術后高復發及致死的主要原因。KiSS1是目前公認的為數不多的腫瘤轉移抑制基因之一，1990年代由Lee和Welch等首次報道的6。后續研究證明，KiSS1定位于1號染色體長臂lq32q41區67，編碼一個大小為145個氨基酸的親水性蛋白，其中，含54個氨基酸、末端羧基酰胺化的殘基片段是孤兒G蛋白偶聯受體(orphan G proteincoupled recepter, GPR54)的內源性天然配體，被命名為metastin8。metastin與其受體GPR54結合后引起一系列生理生化改變，從而抑制腫瘤轉移9。研究發現，KiSS1缺失表達與胃

16、癌、食管鱗狀細胞癌、胰腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、膀胱癌和子宮內膜癌等多種惡性腫瘤的侵襲、轉移密切相關1018。但在HCC的研究中，Ikeguchi等和Schmid等發現 A：未轉染組細胞;B：空載體組MHC/pcDNA3.1細胞;C：轉染組MHC/KiSS1細胞.KiSS1的過表達與HCC的進展相關，這與KiSS1抑制腫瘤侵襲轉移的作用相悖45。因此深入研究KiSS1基因的表達與HCC侵襲、轉移及預后的關系是必要的。本研究構建了真核表達載體pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并經PCR、酶切及測序進行鑒定，結果證實了KiSS1基因cDNA片段正確插入真核表達載體中，載體構建成功。用脂質體介

17、導MHCC97H細胞轉染后，RTPCR、免疫細胞化學和Western blot方法分別從mRNA和蛋白水平進行鑒定，結果顯示，與未轉染組和空載體組細胞KiSS1基因的不表達相比，轉染組細胞其KiSS1基因在mRNA和蛋白水平出現了較強的表達，證實KiSS1基因已轉染入HCC細胞中。此結果說明本研究構建的pcDNA3.1/HisC/KiSS1載體在MHCC97H細胞內能瞬時表達KiSS1基因，為后續建立穩定轉染的KiSS1高表達陽性細胞克隆奠定基礎,為體內外實驗研究KiSS1對人肝癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響提供前提條件。【參考文獻】 1 朱明華. 臟腫瘤病理學研究展望J. 中華病理學雜志,

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