1、團隊科技創新計劃重慶醫科大學檢驗醫學院“泛鷹”科技創新團隊目錄一、基礎實驗（1）課題方向人員配備典 例二、快速檢測診斷儀器研發（2）課題由來人員配備課題進程 第一階段 研發方向分析 （3） （一）現今檢測儀器分析 （二）確定研究方向 第二階段 研發方法調研 （3） （一）整體方向 （二）工作內容 第三階段 研發標志物確立 （4） （一）FABP研究考察 （二）L-FABP檢測調研 第四階段 研發設計方案 （5） （一）設計理念 （二）樣機設計 （三）預實驗 （四）實驗擴充 第五階段 研發分期計劃（7） （一）當前目標 （二）近期計劃 （三）長期規劃三、產品推廣（12）目標規劃產品產出市場調研四

2、、前景展望（13） “泛鷹”科技創新團隊（以下簡稱“泛鷹”團隊）將在接下來的時間里，繼續堅持常規活動，培養更多集信息技術知識、英語技能及科研基礎于一身的人才，在豐富大學生活的同時，吸引更多志同道合的同學加入“泛鷹”科研平臺。“泛鷹”團隊在重慶醫科大學檢驗醫學院腎臟病學分子實驗室的大力支持下，現已有十多名大學本科同學著手自己的創新實驗。以分子腎臟病學為基礎，形成了基礎實驗、儀器研發、產品推廣三個研究項目。一、基礎實驗課題方向 1. Hippo YAP Signal Pathway； 2. WT1和Tgf-beta相互作用關系及作用方式的研究+調控mxi1的miroRNA在這個基因對系膜細胞凋亡和

3、增值中的調控作用； 3. microRNA16-1與Sall1的關系；micro181調控mfoxj1的作用； 4. foxk2在BMP7信號通路里的作用的研究； 5. microRNA通過tak1影響mm細胞的增殖和凋亡； 6. microRNA對小鼠Bmp7/TCf21增殖凋亡的調控； 7. 小鼠腎臟中的BMP信號通路表達譜分析； 8. ert2介導的Talen時間可調控基因敲除等； 9. 這些同學的課題已在博士研究生的指導下順利地開展并初具實驗成果，并且很有希望發表自己的SCI論文，在科研的道路上走出自己的第一個腳印。人員配備 由于“泛鷹”團隊分層次的培養計劃，使得各梯度之間有很好的銜接

4、和帶動作用。在師兄師姐的帶動之下，也有越來越多的同學進入實驗室學習，并能較快掌握基本實驗操作，熟悉分子克隆等知識，獨立完成系列實驗。同學們利用寒暑假等課余時間，在實驗室相互學習，并不斷充實自己，相信“泛鷹”團隊的成員都能陸續做出自己的成績，同時為國家的科研團隊貢獻自己的一份力量。典例現就其中一個課題“ert2介導的Talen時間可調控基因敲除”做一個詳細的介紹：通過在分子細胞試驗和動物實驗，探索它莫西酚可調控的ERT2與Talen融合表達之后，是否能夠實現藥物可誘導的Talen基因敲除，從而實現一種、高效的，時間可調控的基因敲除方式。為了探討ERT2與Talen結合起來實現時間可調控性基因敲除

5、的設想，我們首先需要在體外通過分子生物學手段構建ERT2與Talen的融合表達工具載體。同時為了方便檢測Talen的基因敲除效率，我們需要構建一個靈敏的，可視化的報告系統，為此我們選擇已普遍應用的LacZ和DsRed報告基因，分別設計特異靶向LacZ和DsRed的Talen載體，并將該Talen蛋白編碼框與ERT2融合表達出ert2-Talen融合蛋白，在藥物誘導條件下，通過直接觀察LacZ染色或LacZ酶活性和DsRed熒光蛋白來定性和定量地評價ert2-Talen的切除效率。根據所依托研究機構的現有資源，我們擬進行以下試驗：為了驗證eGFP-ERT2-Talen融合蛋白是否保留了ert2藥

6、物誘導入核功能，我們可以在藥物（它莫西酚）誘導的條件下，直接觀察eGFP的亞細胞分布，以判斷融合蛋白是否入核，其核轉移是否具有藥物依賴性。選取HEK293T細胞，把pCMV-eGFPERT2Talen(LacZ)和pCMV-eGFPERT2 (DsRed) 載體轉染進入細胞，通過觀察eGFP綠色熒光蛋白在胞體內的分布記錄Talen-ERT2的位置，然后在細胞培養基中加入Tamoxifen，使Talen-ERT2融合蛋白在Tamoxifen作用下進入細胞核，再次通過觀察eGFP綠色熒光蛋白在胞體內的分布記錄Talen-ERT2的位置，查明是否入核。藥物依賴的eGFP-ERT2-Talen基因切除

7、效率的驗證為了驗證eGFP-ERT2-Talen對靶基因的切除是否可以被它莫西酚誘導，同時評價對靶基因的切除效率，我們分別將pCMV-eGFPERT2Talen(LacZ)和pCMV-eGFPERT2(DsRed)分別轉染到組成型表達LacZ和DsRed的細胞中，在加入或者不加入它莫西酚藥物的情況下，對細胞進行LacZ染色和Dsred紅色熒光蛋白的觀察，判斷eGFP-ERT2-TALEN融合蛋白是否在Tamoxifen作用下進入細胞核，發揮基因敲除的作用，通過細胞計數評價基因敲除效率。實驗證明，ert2-Talen的融合蛋白可以在Tamoxifen的作用下進入細胞核并進行基因敲除二、快速檢測診

8、斷儀器研發課題由來該研究課題由小組長劉佳寧率先提出，得到“泛鷹”團隊發起人重慶醫科大學檢驗醫學院常務副院長周欽的大力支持。最初的想法源于雅安地震中，有一位被困人員因為長時間被隔絕在廢墟之下，造成血鉀過低，最后因病因查明不及時而面臨生命危險。因此，快速檢測的儀器設備研發與現實社會市場需要是相符合的，具有可行性、合理性和前瞻性，對檢驗事業的發展也很有推動作用。人員配備儀器研發研究小組由本科二年級劉佳寧擔任小組長，集結“泛鷹”團隊中一批充滿科研熱情，對儀器研發有想法和堅持的同學。研發成員的主要年級組成是檢驗本科二年級、一年級同學，其中組長主要負責具體研究方向的確立、調整及任務的分工，二年級同學主要負

9、責儀器各項目的研究把關，一年級同學負責資料查找等輔助工作。課題進程第一階段 研發方向分析(一)現今檢測儀器分析 1. 現今檢測儀器具有特點:自動化、高效化、小型化和大型化。 2. 現今檢測方法:膠乳顆粒增強比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）、酶聯免疫法及膠體金法。 3. PETIA檢測法分析： PETIA檢測試劑所采用的乳膠顆粒多為惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。國外已有多家公司提供納米級表面修飾的微球粒子原料，并廣泛應用于PETIA。這些廠家提供的粒子直徑從20nm4m，檢測的靈敏度得到了極大的改善，檢測靈敏度最高

10、可達到1.0ng/ml。可以作為多克隆抗體和單克隆抗體的載體。納米級粒子的推出解決了對單克隆抗體結合的能力不強，臨床檢測的線性范圍窄，干擾因素多，實驗穩定性差等問題，大大促進了免疫比濁法在臨床上的廣泛應用。(二)確立研究方向 通過周欽院長的聯系，研發小組與學院從事傳感器研究的丁世家教授和從事電化學研究的謝國明教授商議，決定從腎臟病的快速檢測著手，研發儀器主要包括探測器、處理器及顯示器，更近一步地，可以使顯示器信息具備電腦傳輸能力，可以完成遠程傳送。第二階段 研發方法調研（一)整體方向（按照優先等級排序） 1. 搜集目前腎臟方面比較有價值的指標 2. 微流控的整體調研 3. 電化學調研 4. 免

11、疫金調研 5. 招募更多的同事（二）工作內容 1. 人員分配 （1）微流控的調研：劉佳寧 （2）腎臟有價值標記物：辜玉萍、歐欣穎、萬雪穎、倪東升 （3）免疫金調研：曾惜、劉佳、蒙秋蓉 （4）電化學調研：雷紹鵬、向平松 （5）最新技術調研：何琦、王楊燕 2. 微流控總體調研 3. 腎臟病標志物 （1）針對已有的檢測手段進行調研，并選擇性升級 （2) 通過選擇一種或幾種腎臟疾病，對其研究以后選擇標志物進行研究 （3) 借助互聯網網站，在基因水平上進行研究并推測此基因會引發的腎臟疾病，并由此推測出所需檢測蛋白第三階段 研發標志物確立（1） 脂肪酸結合蛋白（FABP）研究考察 1. 人類肝臟脂肪酸結合

12、蛋白（ HL- FABP ）已作為一個細胞內的脂質分子穿梭，在全身代謝平衡中發揮了核心作用。 HL- FABP的參與，在運輸膽鹽已經假定，但幾乎沒有研究。 2. 肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）在體外結合貝特類藥物和PPAR的提高貝特類藥物誘導的PPAR在轉化細胞中，這些研究結果的功能意義不明確的，特別是在正常的肝細胞。與原代培養的小鼠肝細胞的研究表明： （1）在生理葡萄糖（6毫米），貝特類藥物（苯扎貝特，非諾貝特）只有微弱的基因轉錄激活PPAR長鏈脂肪酸的-氧化。 （2）高血糖（ 11-20毫米），但麥芽糖（滲透壓控制）顯著增強，這些和其他PPAR靶基因mRNA的表達增加了長鏈脂肪酸的-氧

13、化的貝特類藥物誘。 （3）苯扎貝特行動所需的高血糖程增強需要一個完整的L-FABP/PPAR所示與L- FABP空，空PPAR ， PPAR抑制劑治療的WT ，或PPAR特定的非諾貝特治療的WT肝細胞的信號轉導通路。因此，高血糖發生程增強PPAR通過FABP / PPAR而非間接通過其他PPARs的或葡萄糖誘導的信號通路。（二）肝臟型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）的檢測調研 1. L-FABP人肝臟型脂肪酸結合蛋白為一種小分子蛋白質，分子量為13KD左右。目前是新型的腎臟疾病早期診斷指標以及肝臟早期病變的檢測指標。現在已有針對L-FABP的ELISA的商品化試劑盒，其檢測范圍為1.56-100

14、ng/nl，；靈敏度為0.64ng/nl。 2. L-FABP在人體中的生理作用主要是轉運長鏈脂肪酸，因其上有一可結合長鏈脂肪酸的特異位點，但是對于其轉運的脂肪酸種類是否為特定某一脂肪酸類型尚不知曉。 3. 研發想法：若是能夠確定L-FABP結合的長鏈脂肪酸的種類，是否可以通過L-FABP與該脂肪酸的結合間接測定其的含量，檢測的方法可以是熒光標記，化學發光類的試劑或是試紙條，也可以是非標記類的如電化學方法，以及膠體金法將其制成快速檢測試紙條。但這種方法的特異性及敏感性，標本中其他物質對其的干擾因素有多大，尚不清楚。但可以在確定的膠體金檢測方法中，檢測時間長是其致命缺點。經過查閱2013年所發表

15、的電化學及生物傳感器方面的檢測方法（文獻來自Biosensors and Bioeletronics），可以借鑒用于L-FABP檢測的方法： （1）與ELISA結合的電化學免疫分析法（Electrochemical impedimetric immunosensor for the Detection of measles-specific Ig-G antibodies after measles infections） 此文獻敘述的主要是將ELISA與電化學分析方法結合，運用于對于麻疹抗體的檢測，該方法檢測麻疹抗體響應時間短，線性范圍寬，不用特異性標記，最低檢測限亦較低，因而較為實用。研發

16、想法：是否可以將麻疹抗體換為L-FABP抗體，用其與L-FABP的特異性結合檢測L-FABP。 （2）基于蛋白質與碳水化合物相互結合作用的電化學免疫分析法（Glycosylated aniline polymer sensor ：Amine to imine conversion on protein-carbohydrate binding）。 此文獻敘述的主要是運用電化學發對刀豆A蛋白的檢測方法。此方法是將刀豆蛋白結合到某個碳水化合物，通過檢測電極電位的變化來反映溶液中的刀豆A蛋白的濃度。我認為可以借鑒的地方在于：有關文獻曾報道L-FABP表面有可以和脂肪酸鏈結合的位點，那么是否可以通過尋

17、找到某個能和L-FABP結合的連接有長鏈脂肪酸的碳水化合物，再套用文獻中檢測刀豆蛋白的方法，檢測L-FABP。第四階段 研發設計方案（一）設計理念【目標】 快速、高效、準確、便攜【設計綜述】 隨著當今社會的發展，對于快速便攜的檢測產品的需求是顯而易見的。并且，在科技不斷進步的今天，新的標志物層出不窮。如何將最新最有效的標志物更快的應用于臨床，將會是十分有前景的研究方向，也是本系列產品的方向。我們的產品將會是以模塊化、系統化呈現。系統主要由四模塊組成：探頭（接觸標本）模塊、處理模塊、顯示模塊以及傳輸模塊。而系統的最精華部分位于探頭模塊，具體可參考移液器我們可以根據不同的檢測需要更換不同的探頭，類

18、似于移液器的槍頭更換一樣簡便。在更換探頭和，通過調節旋鈕來更換程序。由于我們使用電化學免疫傳感器，對于標本不需要進行稀釋等前操作，而其本身檢測時間也短，所以，本產品的使用環境更加廣泛（2） 樣機設計 1. 樣機目標標志物：L-FABP 2. 樣機檢測方法:電化學免疫傳感器測阻抗 3. 樣機預使用電極:絲網印刷石墨電極 4. 待預實驗解決問題: （1）信號放大器的選擇：三極管、變壓器等 （2）檢測電阻部位 1）將電極視為電阻，在結合前后檢測電極電流變化。 2）將標本尿液作電阻，通過檢測結合前后尿液電流變化計算標志物的量。 （3）關于抗體-抗原結合的細節優化：是否需要添加其他物質，使得結合物結合時

19、間更加短，結合物更加穩定 （4）處理器的程序設計 （5）反應中電極電阻變化范圍【參考文獻】 Analysis of DDT Isomers with Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Optical Immunosensor Based on Rat Monoclonal Antibodies as Biological Recognition Elements. 1. Effects of immobilization on a FRET immunosensor for the detection of myocardial infarction

20、2. Monitoring of urinary L-type fatty acid-bingding protein predicts histological severity of acute kidney injury 3. Enzyme immunosesor for diagnosis of myocardial infarction（三）預實驗預實驗一【實驗目標】 驗證在以尿液或類尿液的環境中，通過改變電阻大小導致的電流變化，用哪種放大器效果好【實驗器材】 三極管，變壓器，電解液槽*2，健康人尿液（尿液類似液），電流表*4，電源*2，大小電阻（5種*2組），保護電阻*2，導線若干

21、【實驗原理】 通過檢測對比電流在經過信號放大裝置前后的變化來確定兩個裝置的信號放大能力。【實驗步驟】 1. 組裝好三極管和變壓器裝置 2. 向兩個相同電解槽中加入等量尿液或尿液類似液 3. 連接好包括電源、信號放大裝置、電阻、電流表等的回路 4. 將電阻浸入液體中 5. 記錄四個電流表的讀數 6. 更換電阻后重復步奏5 7. 清洗回收實驗器具【實驗注意事項】 1. 不同電阻間電阻值差距要適中，MIN與MAX參考預實驗5 2. 實驗電源電壓控制在3V，以模擬產品使用干電池情況 3. 在最后評估兩個裝置時，不僅考慮電流放大的倍數，還要討論成本、體積、耐用度、穩定程度 預實驗二【實驗目標】 通過實驗

22、需要確定最終產品檢測電阻的部位是溶液還是電極【實驗器材】 鉑金電極*2，L-FABP抗體，L-FABP溶液，絲網印刷石墨電極*2,電流表，電解液槽*2，電源，健康人尿液（尿液類似液），保護電阻*2，導線【實驗原理】 當以溶液為電阻時，將鉑電極接入回路，石墨電極只接一頭。當以石墨電極為電阻時，鉑電極只放在溶液中，不接入回路，同時將石墨電極兩頭接入回路。通過觀察電流變化評估兩種方法的優缺點【實驗步驟】 1. 將等量L-FABP抗體分別附于兩個石墨電極上 2. 連接好實驗回路，將鉑電極與石墨電極放入電解槽，注入等量液體 3. A組為溶液電阻組，B組為電極電阻組。將A組鉑電極接入回路，B組鉑電極不做處

23、理，將石墨電極兩段接入回路 4. 等待讀數穩定后，記錄電流表數值。并加入等量L-FABP溶液，等待20min 5. 記錄第二次讀數 6. 實驗完畢，清洗回收實驗器具【實驗注意事項】 1. 實驗需要重復多次，方可進行評估 2. 在進行步奏4時，待讀數穩定以后再進行步奏5 3. 評估時，除考慮電流表讀數以外，還要考慮接合的時間長短以及成本問題四、實驗擴充 本實驗中可擴充一組：將A組的鉑電極換為另外一組絲網印刷石墨電極，同時附著等量的L-FABP抗體。以提高對標志物的結合速度第五階段 研發分期計劃（一）當前目標 在2013年寒假著手實驗，將L-FABP樣機成型，并盡快投入檢測。（見圖1）附：顯示器處

24、理器信號放大器以下部分可以替換電極橫截面探頭圖1.程序模塊化草圖（二）近期計劃 通過查閱文獻、進行探究實驗等方式進行儀器的完善，如尋找比單抗更加經濟的標志物結合方式，將顯示器與信息遠程傳輸相結合等。（三）長期規劃 在完成基本儀器的研發之后，根據實際情況著手微流控、免疫金的研究微流控調研詳述。 微流控作為21世紀一項重要的科研產物，隨著現代對科技發展的要求越來越微型化、集成化，微流控技術的前景著實讓人期待。早在1995年便成立了首家微流控公司，1999年推出首款商品化儀器。雖然我國對此技術研究較晚，但我國科學家對此技術已做出卓越成績2006年，我國科學家關于微流控的SCI文章數目躍居全球第二。【

25、定義】 微流控是一門集合生物、化學和醫學分析過程中樣品的制備、反應、分離和最終檢測等基本項目為一塊微米級芯片上的多學科相交叉的技術。微流控將多種單元技術在整體可控制的微米級平臺上組合、集成。正因為此，它與傳統手段相比擁有高靈敏度，高分辨率，高效率以及低消耗，低成本。并且，其集成化的模式大大縮小了設備的體積。從長遠角度看，微流控技術最終能達到設備的小型，快速，精準，低碳還有家庭化。而且由于流體處于微米級別，正賦予了流體很多宏觀條件不具備的特性。【方向】微流控種類多樣化，在與我院科研方向及優勢項目相比較后，重點考查微流控在檢測DNA及蛋白質中的應用【基因檢測】微流控對于基因突變的檢測以乳腺癌為例，BRCA1和BRCA2是乳腺癌的易感基因，微流控技術已用于檢測BRCA1與BRCA2。檢測示意圖見圖2。用微流控對BRACA1與BRCA2的檢測速度比毛細管電泳快1/10，并且可以同時篩查多個突變。【蛋白質研究】在蛋白質研究