1、易錯PCR構建AKP突變體實驗參考資料PCR突變技術方法概覽1基于PCR的體外誘變技術定點突變的方法很多，而基于PCR的定點突變技術由于其突變效率高，操作簡單，耗時短，成本低廉等優點而倍受矚目。近十年來，基于 PCR的定點突變技術獲得了長足的發展，目前運用此技術已能實現各種類型的基因突變。基因突變實驗包括以下幾個步驟：1目的基因全序列變異文庫的構建 ;2利用高通量表達篩選載體從變異文庫中篩選表達突變體；3表達突變體的鑒定和表達研究。1.1 重疊延伸 PCR( over-1 ap extension PCR OE-PCR )這種方法運用非常廣泛、靈活，不受突變位置及突變類型的限制，利用OE-PC

2、R不僅能實現基因點突變，還能便利地實現大片段的插入及刪除及插入。其基本原理如圖(1)所示。首先設計兩個 PCR反應以產生兩個含突變位點的DNA片段，隨后將上述兩個 PCR產物混合，二者通過末端互補區結合并在適宜的溫度下互引物延伸得 到完整的含突變的基因，對第一次PCR產物進行純化處理可顯著提高突變效率。OE-PCR不足之處在于：01 一個突變需要兩對引物，3次PCR,并且需對中間產物進行純 化。相對而言步驟較煩瑣，不經濟；O2由于DNA二級結構及互補鏈的競爭等因素的影響，有時兩個中間產物難于有效地相互結合導致目的產物得率很低；O3當利用Taq聚合酶進行PCR反應時，經常在 PCR產物末端加上腺

3、苷酸，這一多余的腺苷酸一方面導致兩 個中間產物難于有效地相互結合，另一方面可能會插入基因中導致產生非預期的移碼突變。針對這些不足，后來許多學者對OE-PCR進行了改進。1997年，Urben等提出一步重疊延伸PCR法(one-step overlap extension PCR)，使得三個 PCR反應得以在一個試管里進行， 并且省略了煩瑣的中間產物純化過程。其原理是首先將待突變的DNA以相反的方向克隆到兩個載體中，這兩個載體除了多克隆位點相反外其余均相同(例如pUC18,19)。這樣便得到兩個模板。將這兩個模板，兩個突變引物及一個與載體互補的通用引物置于一個試管中進 行一次PCR反應即可得到含

4、突變的目的基因。 1997年，Warrens等利用不對稱 PCR反應 產生單鏈中間產物，消除了互補鏈的競爭性影響，顯著提高了目的產物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶處理中間產物，降低了移碼突變的發生率。由于OE-PCR幾乎沒有任何特殊條件的限制，而且成功率很高，因此運用非常廣泛。第1頁共8頁易錯PCR構建AKP突變體實驗參考資料步報1：錯配的插人第2頁共8頁易錯PCR構建AKP突變體實驗參考資料步驟3：延伸步驟4： PCR擴噌AACQ我示四個引物表示災變位點圖1 aver-lap extension PCR介導的定點突變1.2 大引物 PCR 法(megaprimer PC

5、R)OE-PCR雖然突變成功率很高，但一次突變需要兩對引物，進行三個PCR反應，還需對中間產物進行純化。因此，相對而言成本偏高，操作較煩瑣。大引物PCR法是OE-PCR的改進版，利用大引物 PCR法只需三個引物，兩個PCR反應，而且無需中間產物純化等步驟。其方法是先設置一個 PCR反應產生一個含突變的DNA片段，然后再以此 DNA片段作為引物與原模板退火進行PCR擴增得到含突變的完整的基因。因為作為引物使用的DNA片段較通常的引物要大許多通常有上百堿基，所以命名為大引物PCR法。最初采用的大引物PCR法突變效率較低，只有約50%終產物符合預期的要求，因此后續的篩選鑒定工作量較大。后來許多學者通

6、過對引物進行巧妙設計或對模板進行巧妙處理，從而使得大引物PCR法達到類似 OE-PCR的突變效率。例如，有學者等對模板進行適當的酶切處理 遏制了野生型模板的擴增，提高了突變效率。Te等在設計引物時使第一輪PCR的引物和Tm值引物侗時相應提高退 ，不僅排除低Tm值的引物的干 ，使整個反應能在一個反應管內第二輪PCR的引物長度相差較大， 相應它們的解鏈溫度 Tm值也產生顯著差異這樣第一輪 PCR采用低的退火溫度，之后在無需純化的情況下直接加入高 火溫度，與大引物一起引發第二輪 PCR擴增。基于這一設計 擾,使野生型模板不致被擴增 ，而且省略了大引物的純化步驟進行。B 第一步：引物與模板退火：A B

7、表示 曲引物表示突變位點。A m-.1 mi FEW. wv B第二步：第一次延伸其中一條新生鏈含緩發位點及一個限制性酶切位點jn B第：®il?輪退火、建伸申得到含憲變位點 及兩個限制性酶切位點的PCR產物圖2 PCR定點突變矗理1.3特殊位置堿基的定點突變如上所述，進行一次突變一般需要經歷1到3次PCR及中間產物的純化等步驟。但當需突變的堿基位于某些特殊位置時，就可以簡單地運用一次PCR實現定點突變，下面討論這樣兩種特殊情況。（1）需突變堿基位于基因的末端當需突變堿基位于基因的末端時，定點突變便非常簡單易行。只需設計一對引物，其中一個為突變引物， 含有欲突變的堿基，另一個引物則完

8、全與模板互補。此二引物在5'端均含有適宜的限制性酶切位點及“夾子”序列，以便將擴增產物克隆入載體中，如圖2所示。（2）唯一限制性位點刪除法 （unique site elimination technique USE ）當需突變的堿基附近含唯一的限制性酶切位點時，如圖3所示，可以設計一對引物，其中突變引物含有上述限制性酶切位點及欲突變的堿基。以野生型基因為模板進行PCR擴增。隨后用限制性內切酶將野生型基因的待突變區切除，并將PCR擴增產物與野生型基因的殘留片段連接，從而得到完整的含突變基因。但利用該方法必須注意：突變堿基附近必須 含有一限制性酶切位點， 并且這一位點在整個基因的其他位置

9、不能有。實際運用中符合這一條件的情況不多見，因此這一方法受到很大限制；然而，一旦條件具備，運用這一方法，較 其他方法都要省時省力。PCR擴增E Em1.4擴增環狀質粒全長的突變方法前述幾種方法都既適用于線性DNA也適用于環狀 DNA，然而當待突變的基因已經克隆入環狀質粒時，只能選擇另一類方法進行突變，既：利用一對含突變的引物擴增整個環狀質粒，從而得到含突變的線性DNA，隨后將線性 DNA環化便得到完整的含突變的質粒。由于引物設計策略的不同，這一方法又可以分為兩種：一種方法是一步PCR法(single stepPCR , S-PCR)，兩個引物反向、緊鄰但沒有重疊區，利用高保真聚合酶擴增產物是平

10、末端的線性DNA，需用末端磷酸化和 T4連接酶環化處理，從而獲得具有定點突變的重組子。原 理如圖4所示。另一種方法，以 Stratagene公司開發的定點突變試劑盒為代表，兩個引物 也是反向的并且其 5'端有15個堿基以上的重疊區，擴增產物為帶黏性末端的線性DNA，可自行環化。其原理及步驟見圖5。上述兩種方法理論上說既簡單又經濟，應該成為首選。但事實上要擴增出完整的質粒并非易事，尤其是當質粒較大時，這對聚合酶的質量提出較高的要求，另外循環參數也需精確調節，而且模板質粒要求至少有80%以上是超螺旋的，帶切口的質粒不能作為模板。第4頁共8頁易錯PCR構建AKP突變體實驗參考資料第5頁共8頁

11、易錯PCR構建AKP突變體實驗參考資料突變位點質粒53/PCR擴增JPCR產物亍端硯酸化P51 3'=：= FI H：K產物自身環化 *突變位點質粒114 一步反向PCR ii緞點突變原理示盤1*1待突變位點(3)PCR擴增轉化大腸肝莆*H：R產物自身環化 形戒帶切口的質粒斥突變引物圖S Strutagrne公司的宦點突變方法1.5利用OE-PCR進行插入及刪除突變小片段的插入與刪除完全可以按點突變的方法實現，而大片段的插入與刪除用其他方法很難實現，但 OE-PCR技術使之變得輕而易舉。圖6示意了利用OE-PCR進行刪除突變的方法。PCR擴增b Ld wv«iAC L cPC

12、R產物退火A CI 再次擴冷d-二 4 3 亠一二一AC =«=圖6用OE-PCR法實現刪除突變1.6非連續多核苷酸定點突變的方法該方法建立了一種突變引物延伸單鏈與PCR技術相結合的方法，它能有效地對目的基因進行大區域非連續多核苷酸的定點突變改造。經堿變性后的質粒DNA，先用突變引物延伸單鏈，然后通過PCR擴增得到突變雙鏈 DNA。與經典的含U單鏈寡核苷酸定點突變方法相 比，本方法突變效率高，并省去了對突變克隆雜交篩選的操作。該方法綜合了質粒雙鏈DNA測序中的堿變性和寡核苷酸定點突變中的突變引物延伸 即突變引物與堿變性的單鏈模板先結合并延伸，產生含突變位點的單鏈，再通過PCR擴增出雙

13、鏈。在突變引物中，由于突變位點是分散的，被突變位點間隔的核苷酸能否與模板結合起到 穩定突變引物，模板雜交體的作用尚不清楚。 但從結果來看，當突變引物3 '端一側有9個堿 基與模板完全配對，即能保證雜交體的足夠穩定和延伸反應的正確性。延伸反應后，先高溫變性，再緩慢降溫，推測這有利于被堿變性解鏈的兩條完全互補的單鏈重新退火結合，使反應體系中有較多的突變引物延伸的單鏈。在PCR第一個循環中，省去加熱變性步驟，通過3'端引物與反應體系中游離的單鏈結合和延伸，為后續循環反應的5'端（突變）引物提供單鏈模板然后在嚴謹退火條件下，使5'端和3 '端引物分別與各自完全配

14、對的模板結合，從而得到與突變設計一致的雙鏈片段。除了用環狀質粒DNA作為模板，本方法也適用于線性雙鏈DNA模板。2 PCR介導的隨機突變一般來說，只有當對某段序列的功能有確切了解，已知改變某個或某幾個堿基可能會產生明顯的效果時才采用定點突變法。然而在很多情況下，研究者對目的序列的了解是很有限的，這時為了研究目的序列的功能往往需要引入大量的隨機突變，構建突變庫，再逐個篩選和鑒定。隨機突變常采用化學或自然誘變法，PCR法并不常用，然而事實上PCR法介導隨機突變非常有效，特別是當隨機突變需局限在一小段區域時。PCR介導隨機突變主要有兩種策略，一種是利用簡并引物，簡并引物的特點是其5'端有十幾

15、個堿基是隨機組合的。這一方法除引物特殊外，其余均與定點突變技術完全一樣。利用簡并引物可以產生大量隨機突 變，并且這些突變都集中在很窄的一段區域內。另一種方法即易錯PCR技術(error-pronePCR),其原理在于，忠實性較低的聚合酶如 Taq在特定措施下很容易向擴增產物中摻入隨 機突變，這些措施包括提高 Mg2+濃度，改變dNTP的比例，調節熱循環參數等。易錯PCR 技術突變率較低，經一次突變的基因很難獲得滿意的結果，由此發展出連續易錯PCR(Sequential error-prone PCR)策略，即將一次 PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴增的模板，連續反復地進行隨機誘

16、變，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益 突變。基于PCR技術的隨機誘變方法構建的全基因序列變異文庫分別重組進篩選載體pUC18-GFP中。外源基因從 GFP基因的5'端重組進篩選載體、轉化大腸桿菌，如果一個重組質粒可以表達外源蛋白與 GFP的融合蛋白，含此重組質粒的轉化菌落在紫外光下將會發出綠色的熒 光。據此能夠篩選到可在篩選載體中表達的外源基因。3化學或物理方法誘發基因突變3.1輻射典型的物理誘變劑是不同種類的射線，常見的有X射線，r射線和中子，此外還有紫外線和B射線。X射線是種波長為1000 - 100埃的電離射線，是最早的誘變射線。r射線是一種波長更短的電離射線，其波長0.

17、1 1埃，60Co和137Cs是目前應用最廣的r射線源。中子是不帶電粒子，在加速器或核反應堆中得到能量范圍極廣的中子。252Cf自發裂變中子源可應用誘發突變。B射線是電子或正電子的射線束，由32P和35S等放射性同位素直接發生的。透過植物組織能力弱，但電離密度大。當同位素溶液進入組織和細胞后作為內照射而產生誘變 作用。X射線和r射線都是能量較高的電磁波，能引起物質的電離。 當物體的某些較易受輻射敏感的部位受到射線的撞擊時，而發生離子化，可以引起DNA鏈斷裂，當修復時不能恢復到原狀就會出現突變。如果射線擊中染色體則可能導致斷裂，在修復時可能造成缺失、重復、倒位和易位等染色體畸變。中子不帶電，但當

18、與生物體內的原子核撞擊后，使原子核變換產生r射線等能量交換，從而影響DNA和染色體的改變。3.2化學誘變劑化學誘變劑種類很多，如工業污染中的煤煙和汽車廢氣中的苯并芘，工業試劑及工業原料中的乙烯亞胺、甲醛，食品工業中的亞硝酸鹽，食品污染中的黃曲霉毒素等等，都可以引起突 變。化學誘變劑誘變機理： 烷化劑：指具有烷化功能的化合物，帶有一個或多個活性烷基，該烷基轉移到一個電子密度較 高的分子上，可置換堿基中的氧原子，堿基被烷化后，DNA在復制時會導致配對錯誤，產生突變。疊氮化鈉：一種動植物的呼吸抑制劑，可使復制中的DNA的堿基發生替換，從而導致突變體的發生，是目前誘變率高而安全的一種誘變劑。化學誘變劑

19、的處理方法： 利用化學誘變劑處理種子較為普遍，其方法是直接把種子浸泡在含有化學試劑的溶液中，可以誘發各類體細胞突變。一般來說，玉米種子的處理效果較差，因為成熟的玉米籽粒胚中具 有分開的、已定型的雄花和雌穗原基細胞，并且在突變發生過程中容易產生細胞間的競爭， 使突變細胞受到抑制或消亡，被排斥在生殖過程之外。用含有化學藥劑的石蠟油處理玉米花粉是目前已知的最有效的方法。以EMS為例，具體的處理方法步驟如下：用 EMS與輕質石蠟油混合，制備成濃度為0.1-0.2%EMS處理液；在適當的時間，收集玉米新鮮花粉，在一個帶蓋的瓶中，把花粉與EMS處理液混合；最后用一把小號毛刷，把被處理花粉涂到選好的雌穗花絲上。其他誘變因素 除輻射和化學誘變劑外，過高或過低的溫度也可能引起突變。4 PCR誘變法與其他誘變法的比較基因誘變的方法很多，除了基于PCR各種誘變法外，常用的方法還有化學誘變、寡核苷酸介導的誘變和盒式誘變等。在此將各種誘變方法作一個簡單的比較。4.1化學誘變化學誘變法常用來介導大范圍的隨機突變，其優點在于突變范圍廣、效率高、成本低， 操作也相對較簡單。 缺點在于突變范圍不可控制，重復性差。另外，其最大的缺點在于所用的誘變試劑往往是劇毒或致癌劑