1、代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)方案代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)基本思路如何終止如何終止關(guān)鍵因素：酶活、溫度、溶劑、時(shí)間關(guān)鍵因素：酶活、溫度、溶劑、時(shí)間方法：方法：60%甲醇、甲醇、50%甘油水溶液；甘油水溶液；5min，1h.如何分離如何分離關(guān)鍵：菌體形態(tài)；發(fā)酵液關(guān)鍵：菌體形態(tài)；發(fā)酵液粘稠度粘稠度方法：離心，過濾方法：離心，過濾如何提取如何提取如何監(jiān)測(cè)如何監(jiān)測(cè)如何分析如何分析如何解釋如何解釋核心問題關(guān)鍵因素關(guān)鍵關(guān)鍵：細(xì)胞壁：細(xì)胞壁方法：

2、超聲破碎、研磨、反復(fù)冷凍方法：超聲破碎、研磨、反復(fù)冷凍關(guān)鍵關(guān)鍵：是否具有揮發(fā)性；論文目的：是否具有揮發(fā)性；論文目的方法：方法：GC-MS；LC-MS；或者兩者聯(lián)用；或者兩者聯(lián)用關(guān)鍵關(guān)鍵：數(shù)據(jù)是否具有同步性？系統(tǒng)誤：數(shù)據(jù)是否具有同步性？系統(tǒng)誤差小差小方法：方法：Matlab、NIST library、Golm metabolome database、AMDIS關(guān)鍵關(guān)鍵：解釋：解釋FK506高產(chǎn)原因高產(chǎn)原因方法：與方法：與FK506的合成相關(guān)聯(lián)（前體？的合成相關(guān)聯(lián)（前體？分支代謝？能量？）分支代謝？能量？）終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取

3、胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）方案方案一一【1】5mL20mL甘油：水=3:2【1】Villas-Bas, S.G. and P. Bruheim, Cold glycerolsaline: The promising quenching solution for accurate intracellular metabolite analysis of microbial cells. Analytical Biochemistry, 2007. 370(1): p. 87-97.【2】Smart, K.F., et al

4、., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10): p. 1709-1729.【3】Blling, C. and O. Fiehn, Metabolite Profiling of Chlamydomonas reinhardtii under Nutrient Depriva

5、tion. Plant Physiology, 2005. 139(4): p. 1995-2005.方案二方案二【2】5mL20mL甘油：生理鹽水水=3:25min5min關(guān)鍵：終止酶活方法：胞內(nèi)溫度-10溶液溫度：根據(jù)細(xì)胞壁的厚度而定策略：用甲醇或者甘油降低水的凝固點(diǎn)公式：Tf = Tf* Tf = Kf*m（m為溶液的質(zhì)量摩爾濃度，Kf 為凝固點(diǎn)下降常數(shù)）方案二方案二【3】5mL20mL甲醇：水=3:2（可變動(dòng)）5min培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代

6、謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋關(guān)鍵： 菌體的形態(tài)、發(fā)酵液的粘稠度方法：離心【1】淬滅液雙蒸水0.22m0.45m0.8m1.0m失敗原因：失敗原因：絲狀菌體，相互交聯(lián)，堵塞孔徑。淀粉、葡萄糖、和糊精滅菌后，本身就是一種“漿糊”，嚴(yán)重堵塞孔徑廢液缸1.轉(zhuǎn)速和時(shí)間 時(shí)間一般為4min5min，轉(zhuǎn)速的大小根據(jù)具體的菌體而定：離心結(jié)束后，菌體剛好貼在管壁，不結(jié)團(tuán)，加入PBS或蒸餾水后，輕微震蕩即可重新懸浮。2.天然復(fù)合培養(yǎng)基面臨天然復(fù)合培養(yǎng)基面臨的難題的難題 天然復(fù)合培養(yǎng)基（主要為蛋白胨、酵母粉）成分復(fù)雜，如果清洗不干凈，會(huì)混入提取液中，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.生理鹽水中的生理鹽水中的NaCl和和PBS中的鈉鹽、

7、鉀鹽會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的鈉鹽、鉀鹽會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。整個(gè)過程必須帶手套，槍頭不能接觸其他物質(zhì)。整個(gè)過程必須帶手套，槍頭不能接觸其他物質(zhì)。4.FK506發(fā)酵液的處理發(fā)酵液的處理轉(zhuǎn)速為2700rpm，4min采用去離子水洗滌菌體將培養(yǎng)基中的酵母粉（不溶物）改為酵母提取物（可溶）過濾清洗【2】淬滅液PBS或生理鹽水或蒸餾水菌體沉淀重復(fù)三次【1】Smart, K.F., et al., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization follow

8、ed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10): p. 1709-1729.【2】Ding, M.-Z., X. Zhou, and Y.-J. Yuan, Metabolome profiling reveals adaptive evolution of <i>Saccharomyces <i>cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics, 2010. 6(1):

9、 p. 42-55.終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取關(guān)鍵因素：細(xì)胞壁G+菌菌單層單層，（，（2080nm），），組組分分簡(jiǎn)單。簡(jiǎn)單。90%的肽聚糖的肽聚糖（含量高，交聯(lián)度大），（含量高，交聯(lián)度大），10%的胞壁酸。的胞壁酸。G-菌菌多層，（多層，（10-15nm），），組組分復(fù)雜。內(nèi)壁層還有較分復(fù)雜。內(nèi)壁層還有較少的肽聚糖（含量低，少的肽聚糖（含量低，交聯(lián)度疏松，交聯(lián)度疏松，2-7nm），），外膜層為脂多糖、磷脂外膜層為脂多糖、磷脂和脂蛋白

10、，約和脂蛋白，約8nm真菌真菌厚厚25nm，占細(xì)胞干重的，占細(xì)胞干重的25%。分為三層：葡聚糖、。分為三層：葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)甘露聚糖和蛋白質(zhì)方法：三輪冷凍與解凍液氮-196中冷凍5min，冰上0解凍15min液氮研磨稱量反復(fù)冷凍超聲破碎菌體研磨終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋氣質(zhì)聯(lián)用要求：沸點(diǎn)350，分子量1000，能完全氣化，氣化后對(duì)色譜柱和儀器無損傷（比如Ar、二氧化碳、水、甲醇、HCl和HNO3等）適用物質(zhì)：主要是有機(jī)類小分子物質(zhì)，包括烷，醇，胺，酯，醚

11、，烯，酮，醛，羧酸，呋喃和吡啶衍生物，異氰酸酯、異硫氰酸酯、硫化物和一些脂類。特點(diǎn)：測(cè)定的物質(zhì)少（相對(duì)于液質(zhì)）靈敏度高，精度高，適合測(cè)定nmol級(jí)的物質(zhì)關(guān)鍵因素：分子量1000沸點(diǎn)350或者通過衍生化，能夠具有揮發(fā)性（300成氣態(tài)）胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)-氣質(zhì)聯(lián)用氣質(zhì)聯(lián)用終止反應(yīng)（淬滅）終止反應(yīng)（淬滅）培養(yǎng)基與菌體分離培養(yǎng)基與菌體分離胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物提取胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)解釋代謝組學(xué)解釋關(guān)鍵因素：分子量0-10,000胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)胞內(nèi)代謝物監(jiān)測(cè)-氣質(zhì)聯(lián)用氣質(zhì)聯(lián)用已知化合物中約80%的化合物是親水性強(qiáng)、揮發(fā)性低的有機(jī)物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子

12、，這些化合物的分析不適宜用氣相色譜分析，只能依靠液相色譜最終的實(shí)驗(yàn)方案最終的實(shí)驗(yàn)方案 淬滅與提取淬滅與提取5mL三輪冷凍與解凍液氮中冷凍5min，冰中解凍15min（地點(diǎn)：東配）發(fā)酵液（地點(diǎn)：東配）震蕩2s25ml、-40的60%甲醇，5min40乙醇浴-9、3500rpm、離心5min5ml去離子水溶液4，離心3次-9、5000g、離心5min2ml、-30、50%的甲醇溶液-9、5000g、離心5min2ml冷甲醇水溶液(50% (vol/vol), 30 重新懸浮重新懸浮-9、5000g、離心5min-80儲(chǔ)藏50%甲醇：4mL60%甲醇：25mL 1個(gè)2.63%NaCl:5mL-40乙醇浴容器：1個(gè) -30乙醇浴容器：1個(gè)5mL移液槍、1mL移液槍普通冰盒：1個(gè)（提前裝好冰）離心機(jī)需提前30min調(diào)節(jié)溫度至-9-80冰箱需提前跟小聞老師協(xié)商以上試劑必須提前一天在對(duì)應(yīng)的溫度保藏測(cè)定菌體干重液氮稱取稱取5mg最終的實(shí)驗(yàn)方案最終的實(shí)驗(yàn)方案 衍生化衍生化-80儲(chǔ)藏0.5ml1.5ml離心管0.3mg/ml （濃度231um/l）D4 succinic acid 50ul 1.5ml離心管震蕩1min冷凍5min1.5ml離心管60ul（50ul）20mg/ml甲氧胺鹽酸 30反應(yīng)90min80ul MSTFA 3