1、土壤中脫氫酶活性的測定殷曉晨，武亨杰，朱承彬（中國石油大學 化學化工學院，山東 青島266555）摘要：為了研究土壤中微生物降解有機物的能力，設計實驗，采用TTC分光光度法測定受石油污染并接受生物修復的各土壤樣品中脫氫酶的活性。研究表明，所采集的土壤樣品中脫氫酶的含量很少，基本無法用本方法檢測出，說明土壤在過去的一年里發生了某些變化使脫氫酶含量降低。關鍵詞：土壤；脫氫酶；TTC；紫外分光光度法中圖分類號： X705 文獻標志碼：AMeasurement of Catalase Activity in SoilYin Xiao-chen, Wu Heng-jie, Zhu Cheng-bin（C

2、ollege of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum，Qingdao266555，China）Abstract: This experiment is designed to investigate the ability of microorganisms in soil to degrade organic matters. The dehydrogenase activity in soil which was contaminated by petroleum and then biolo

3、gically repaired was measured by the method of ultraviolet spectrometry. The research shows that the content of dehydrogenase in soils samples are so minute that cannot be detected by this method.Key words: soil; dehydrogenase; TTC; ultraviolet spectrometry. 土壤中的微生物對于有機物的降解，實質上是微生物經過一系列的酶的催化作用下的生物氧化

4、還原反應。參加生物氧化的重要酶為氧化酶和脫氫酶二大類，其中脫氫酶類尤為重要。其中脫氫酶能使氧化有機物的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體實現有機物的氧化和轉化。如果脫氫酶活化的氫原子被人為受氫體接受，就可以通過直接測定人為受氫體濃度的變化間接測定脫氫酶的活性，表征生物降解過程中微生物的活性。因此，脫氫酶的活性可以反映土壤體系內活性微生物量以及其對有機物的降解活性，以評價降解性能。脫氫酶活性測定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得較多的為氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。利用TTC作為人為受氫體，無色的TTC受氫后變成紅色的TPF（三苯基甲月替），根據紅色的深淺，測出相應的吸光度值，從

5、而計算TPF的生成量，求出脫氫酶的活性。本實驗使用TTC分光光度法測定土壤中脫氫酶的活性。1. 實驗1.1 實驗器材 本實驗所用器材為721分光光度計，比色皿，三角瓶，容量瓶，漏斗，濾紙等。1.2 試劑1mg/mL TTC溶液（繪制標準曲線）：稱取0.5gTTC，溶解，定容至500mL；1% TTC溶液（土壤測定）：取1g TTC，溶解，并定容至100mL容量瓶中；Tris-HCl緩沖溶液（pH=7.6）：稱取6.037g Tris（三強甲基氨基甲烷，分析純），再加入1mol/L的鹽酸，調pH值為7.6；1.3土壤樣品 本實驗土壤樣品取自于受石油污染并接受生物修復的位于東營市的土壤，共有14個

6、土壤樣品。1.4 實驗方法1.4.1 TPF標準曲線的繪制 配制系列濃度的TTC標準溶液：取8個50mL容量瓶，分別吸取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL 1mg/mL TTC溶液加入以上容量瓶中，用蒸餾水定容。繪制標準曲線：取8支具塞試管，分別依次加入2mL Tris-HCl緩沖溶液（pH=7.6）、2mL蒸餾水和2mL不同濃度的TTC標準溶液（空白對照用蒸餾水代替TTC溶液）。然后分別加入0.1g低亞硫酸鈉（保險粉），振蕩搖勻。待充分顯色后，加入5mL甲苯，振蕩萃取微紅色的TPF，上清液于485nm處測定吸光度值。 以TPF的濃度為橫坐標，以吸光度A值為

7、縱坐標繪制標準曲線。1.4.2 土樣測定 分別取5g 過1.25mm篩的新鮮土壤樣品于具塞三角瓶中，每個三角瓶加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸餾水，充分混勻。置于37恒溫箱中避光培養6h。培養結束后，加入5mL甲醇，劇烈震蕩1min，后靜置5min，再振蕩20s，然后靜置5min。將三角瓶中的物質全部過濾到比色管中，并用少量的甲醇洗滌三角瓶2-3次，洗滌液也全部過濾到比色管中，定容到25mL，于485nm下測定吸光度值A，以每g干土生成的TPF為脫氫酶的一個活性單位。2. 結果分析表1 標準曲線繪制數據表C(TTC)/(ug/ml)空白10 20 30 40 50 60 70 C(TPF)

8、/(ug/ml)0 3.59 7.18 10.77 14.36 17.95 21.54 25.13 吸光度 A0.000 0.127 0.233 0.331 0.434 0.538 0.648 0.754 例：1號TTC溶液C(TPF)/(ug/ml)=10ug/ml*2ml*300.46/(334.8*5ml)繪制的標準曲線如圖所示：圖1 脫氫酶吸光度標準曲線表2 土壤中脫氫酶活性數據表土樣土樣質量/g吸光度土樣土樣質量/g吸光度北中一5.0034 0.006 右二5.0011 0.006 北中一（平行）5.0020 0.008 右三5.0013 0.008 南右一5.0017 0.005

9、北左一5.0022 0.007 南右一（平行）5.0019 0.006 北左二5.0009 0.008 左一5.0023 0.008 北中二5.0016 0.006 左一 （平行）5.0024 0.007 南左一5.0014 0.007 左二5.0016 0.006 北右一5.0014 0.008 左三5.0011 0.005 北右三5.0018 0.006 右一5.0021 0.008 空白0.0000 0.000 注：由于吸光度值太小，無法計算酶活性3.實驗討論實驗過程中，考慮到處理過程中微生物對環境的適應特點，將樣品培養溫度控制在37為宜。另外，由于TTC具有較高的光敏感性，整個實驗過程

10、盡量嚴格在避光的條件下進行。第一次實驗用風干土樣嚴格按以上步驟進行，過濾后濾液基本為無色透明，吸光度值均在0.001-0.009之間，分析原因，可能由于甲醇存取效果不好，遂于第二次實驗時換成甲苯，離心后發現上部液體呈黑色，無法測定吸光度。第三次實驗將樣品于37下培養18h，用甲醇作萃取劑，仍無顯色，分析原因可能由于風干土樣中酶活性較低，因此第四次實驗采用新鮮土樣，嚴格按照以上步驟進行，并從校園任取兩處土樣作為對照。實驗結果為：從東營所采土樣吸光度值依然極小，而校園土過濾后明顯呈微紅色，測定吸光度值分別為0.013和0.137。認真檢查后藥品儀器無問題，操作無不當，原因只能在于土壤樣品中脫氫酶含量極少，用普通的分光光度法無法準確檢測出。參考文獻：1 關松