1、內(nèi)源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是大鼠對(duì)抗心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)因子摘要目的：觀察內(nèi)、外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在大鼠心臟缺血/再灌注(I/R)損傷中的作用。方法：在大鼠離體心臟I/R模型上分別給以bFGF和bFGF抗血清，以生理多導(dǎo)儀測(cè)定心率、LV dp/dtmax及左心室終末舒張壓(LVEDP)變化，并測(cè)定冠脈流量、冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量、乳酸鹽脫氫酶(LDH)活性以及心肌組織鈣、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和蛋白激酶(PKC)、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性。結(jié)果：I/R組心功能顯著低于對(duì)照組，冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量、LDH活性及心肌MDA

2、、鈣含量顯著升高，ATP含量顯著降低(均P0.01)。bFGF組LV dp/dtmax較I/R組分別高42.8和25.6，LVEDP低40.0，再灌末心率/預(yù)灌末心率(HRr/HRi)及冠脈流量的(B/A)分別高42.3和20.3，冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量及LDH活性分別少28.8、30.2(均P0.01)和32.3(P0.05)，心肌MDA和鈣含量分別少44.4和35.6，ATP含量高33.8。心肌PKC、MAPK活性分別高41.3和10.1(均P0.01)；bFGF抗血清組LV dp/dtmax較I/R組分別低35.1和38.1，LVEDP高92.5，HRr/HRi及冠脈流量的B/A

3、分別少36.0和45.4%，冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白和LDH漏出分別多54.3%、96.2%和34.4%，心肌MDA和鈣含量分別高23.6%和49.7%，ATP含量低27.8%，心肌PKC及MAPK活性分別低20.9%和7.7%(均P0.01)。結(jié)論：內(nèi)源性bFGF是大鼠對(duì)抗心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)因子。主題詞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性；心臟；再灌注損傷；信號(hào)傳遞；大鼠中分類號(hào)R541.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)06-0486-05 Endogenous basic fibroblst growth factor is a protective factor aga

4、inst myocardial ischemia/reperfusion injury of ratsJIANG Zhi-sheng， WANG Xiao-hong， FU Min-gui，ZHAO Wen， LI Shu-lian, TANG Chao-shu(Institute of Cardiovascular Research, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)AbstractAIM: To observe the role of exogenous and endogenous bas

5、ic fibroblst growth factor (bFGF) on myocardial ischemia/reperfusion(I/R) injury of rats.METHODS:bFGF and bFGF antiserum were applied to rat isolated I/R heart. Myocardial function, coronary effluent volume,protein and myoglobin content as well as LDH activity in coronary effluent fluid, myocardial

6、calcium， MDA and ATP concentration as well as PKC， MAPK activity were measured. RESULTS:Compared with control, myocardial function in I/R group significantly decreased. Protein, myoglobin content and LDH activity in coronary effluent liquid as well as myocardial MDA and calcium content increased, wh

7、ile myocardial ATP concentration decreased(all P0.01). Compared with I/R group, LV dp/dtmax in bFGF group increased by 43% and 26%, respectively. LVEDP decreased by 40%. HRr/HRi and B/A augmented by 42% and 20%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity lowered by 29%，30 (a

8、ll P0.01) and 33 (P0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content decreased by 44% and 35%, respectively, while myocardial ATP level as well as PKC and MAPK activity increased by 34%，41 and 10% (all P0.01), respectively. In bFGF antiserum group, LV dp/dtmax were 35% and 38% lower than those

9、in I/R group. LVEDP increased by 93%. HRr/HRi and B/A decreased by 36% and 45%, respectively. Protein and myoglobin content as well as LDH activity augmented by 54%，96 (all P0.01) and 34 (P0.05) respectively. Myocardial MDA and calcium content increased by 24% and 50%, respectively, while myocardial

10、 ATP level as well as PKC and MAPK activity lowered by 28%，21 and 8% (all P0.01), respectively. CONCLUSION:Endogenous bFGF is a protective factor against myocardial ischemia/reperfusion injury of rats.MeSHFibroblast growth factor,basic; Heart; Reperfusion injury; Signal transduction; Rats 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因

11、子(basic fibroblast growth factor,bFGF)廣泛分布于體內(nèi)各組織中，具有促進(jìn)細(xì)胞分化、發(fā)育、遷移、增殖等與絲裂作用有關(guān)的多種生物學(xué)效應(yīng)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該因子還可誘導(dǎo)血管壁一氧化氮合酶(NOS)活性，促進(jìn)一氧化氮(nitric oxide，NO)產(chǎn)生1，舒張血管，拮抗高血壓的形成2，并能縮小心肌梗塞的面積3等。提示bFGF的非絲裂作用亦具有重要的生理、病理意義。有報(bào)道，心肌缺血、缺氧時(shí)，bFGF的產(chǎn)生增加4，但內(nèi)源性bFGF在心臟缺血缺氧損傷中的作用尚不十分清楚。本工作在離體大鼠心臟缺血/再灌損傷模型上，通過(guò)使用bFGF抗體，觀察內(nèi)源性bFGF的作用。材料和方法一

12、、 大鼠離體心臟灌流模型制備5及實(shí)驗(yàn)分組雄性Wistar大鼠24只，體重(22010) g。術(shù)前禁食過(guò)夜，自由飲水。以20烏拉坦(5 mL/kg,ip)麻醉動(dòng)物，摘取心臟迅速懸掛于Langendorff灌流裝置上，用37、95O2-5CO2持續(xù)平衡的Krebs-Henseleit(KH)液自主動(dòng)脈逆行恒壓灌流，灌流壓為7.8 kPa。實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)對(duì)照組，持續(xù)灌流90 min。(2)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)組，預(yù)灌15 min，停灌(保溫、保濕)45 min，再灌注30 min。(3)bFGF組，灌流方法同I/R組，再灌注的最初5 min給予8 g

13、 bFGF。(4)bFGF抗體組，灌流方法同I/R組，再灌注的最初5 min給予1bFGF抗血清灌流。二、心功能測(cè)定從左心耳插入球囊，通過(guò)壓力換能器連接生理多導(dǎo)儀，記錄預(yù)灌末及再灌末左室內(nèi)壓最大變化速率(LV dp/dtmax)和左室舒張末期壓(LVEDP)。三、冠脈流量及冠脈流出液中乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、蛋白及肌紅蛋白含量的測(cè)定分別收集預(yù)灌末5 min或相應(yīng)時(shí)間(對(duì)照組)及再灌末5 min或相應(yīng)時(shí)間(對(duì)照組)的冠脈流出液，測(cè)定冠脈流量，并用Brabford法6、Elz法7及全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定冠脈流出液中蛋白含量、肌紅蛋白含量及LDH活性

14、。四、心肌組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)及鈣含量的測(cè)定灌流結(jié)束后，取約50 mg心室肌以硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，以原子吸收分光光度法測(cè)定心肌組織鈣含量，以放免藥盒測(cè)定三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量。五、心肌組織蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性測(cè)定8將心肌組織以穿細(xì)胞液(mmol/L: HEPES 12.5,EGTA 12.5,pH 7.4,MgCl2 5.2, KCl 194.0, CaCl2 8.2, PKC底物肽0.2 IU/管, streptolysin 0.3 IU/管)勻漿(4)，取勻漿液1

15、50 L，37孵育10 min，加入-32P(ATP(37 kBq/管)啟動(dòng)反應(yīng)，再孵育10 min后加入冷終止液(25%三氯醋酸-2mol/L乙酸 )100 L終止反應(yīng)。冰浴10min 后離心(3000 r/min,15 min)，取上清液120 L點(diǎn)于p81離子交換色譜濾紙上，晾干后以洗脫液(30%乙酸-1%磷酸)洗2次，再以無(wú)水乙醇洗1次，干燥后加入閃爍液，以液閃儀(Backman LS6000)測(cè)定放射活性。同時(shí)作不加PKC底物肽的對(duì)照檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管的差值表示PKC活性(counts*min-1/3105 cells) 。六、心肌組織絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activ

16、ated protein kinase,MAPK)活性測(cè)定參照本室報(bào)告的方法9測(cè)定心肌組織MAPK活性。心肌組織以細(xì)胞溶解液(mmol/L: HEPES 50.0, pH7.5, NaCl 150.0, Na4P2O2 10.0, Na3VO4 2.0, NaF 100.0, PMSF 1.0, DTT 2.0, aprotin 100 U/mL, leupeptin 20 mol/L,Triton-100 1%)勻漿，勻漿液離心，13 000g,10 min。取上清液0.1 mL加入0.1 mL激酶緩沖液(mmol/L: HEPES 20.0, pH 7.2, MgCl2 10.0, MnC

17、l2 2.0, DTT 2.0, Na2VO4 0.5, EGTA 1.0, 蛋白激酶A抑制劑 2.0, BSA 0.1 mg/mL, ATP-Na2 50 mol/L, -32PATP (37 kBq),并加入髓磷脂堿性蛋白1.0 mg/mL)于30反應(yīng)15 min。冰浴終止反應(yīng)。取100 L 反應(yīng)液點(diǎn)于p81 phosphocellulose濾紙(Whatman)上，涼干后以0.5%磷酸液沖洗6次，烘干后置于閃爍瓶中，加入閃爍液靜息過(guò)夜。在液閃儀上測(cè)定放射活性，同時(shí)作空白對(duì)照檢測(cè)，以實(shí)驗(yàn)管與空白管的差值表示MAPK活性(counts*min-1/3105 cells)。七、材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由本

18、校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。重組人bFGF為北京白鷺園生物技術(shù)公司產(chǎn)品，bFGF抗血清(兔抗人)為本室制備，滴度1:25 000。ATP藥盒、PKC底物肽、髓磷脂堿性蛋白、aprotin、leupeptin、蛋白激酶A抑制劑、ATP-Na2等均購(gòu)自Sigma公司，-32P-ATP購(gòu)自Dupont Co.。余均為市售分析純?cè)噭０恕?統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以s表示，one way ANOVA方差分析組間q檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果一、 bFGF對(duì)離體大鼠心臟缺血/再灌損傷的影響心臟再灌后冠脈流量明顯降低，其再灌末冠脈流量(B)與預(yù)灌末冠脈流量(A)之比值(B/A)較對(duì)照組少46.9%(表1,P0.01)；冠脈流出液

19、中蛋白含量、肌紅蛋白含量及LDH活性較對(duì)照組分別高1.4、 2.3和3.2倍(均P0.01)，心肌組織MDA和鈣含量分別高212.4%和92.2%(1，均P0.01)，心肌ATP含量少53.0% (P0.01)。說(shuō)明心肌發(fā)生明顯損傷。表1bFGF及其抗體對(duì)大鼠缺血/再灌心臟冠脈流量及再灌末冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量和乳酸脫氫酶活性的影響Tab 1The effect of bFGF and bFGF antiserum on coronary effluent volume，protein and myoglobin content and LDH activity in coronary

20、 effluent fluid(s ,n=6)GroupRCEV(%)Protein(g/mL)Myoglobin(g/mL)LDH(IU/L) Control90.83.9*18.12.1*1.60.3* 38.012.2*I/R48.23.2 43.12.25.30.5 160.041.2bFGF58.04.0*30.72.5*3.70.3*108.316.5*Anti-bFGF26.33.4*66.58.6*10.41.5*215.044.7* P0.05, * P0.01, vs I/R group； RCEV: ratio of coronary volume Fig 1The ef

21、fect of bFGF and bFGF antiserum on calcium，ATP and MDA content of rat ischemia/reperfusion myocardium(s,n=6)* P0.05, * P0.01, vs I/R group1bFGF及其抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌鈣、ATP和MDA含量的影響應(yīng)用bFGF抗血清明顯加重心肌缺血/再灌注損傷，與I/R組比較，其冠脈流量的B/A值低45.4%(P0.01)，心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白、肌紅蛋白和LDH漏出分別多54.3%、96.2%和34.4%(均P0.01)，心肌MDA和鈣含量分別高23.6%和49.7%(P

22、0.01)，ATP含量少27.8%(P0.05)。給以外源bFGF后，心肌缺血/再灌注損傷程度顯著減輕。與I/R組比較，冠脈流量的B/A值多20.3%(P0.01)，再灌末冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量和LDH活性分別低28.8 %、30.2%(P0.01)和32.3%(P0.05)，心肌MDA和鈣含量分別低44.4%和35.6% (P0.01)。ATP含量多33.8%(P0.01)。二、bFGF對(duì)缺血/再灌大鼠心臟心功能的影響I/R組再灌末心功能明顯受損，LV dp/dtmax分別比對(duì)照組少41.8%和40.0%(P0.01)，左心室終末舒張壓(left ventricular end-di

23、astolic pressure, LVEDP)高81.8%(P0.01)，再灌末心率(HRr)與預(yù)灌末心率(HRi)之比(HRr/HRi)少45.0% (P0.01)。應(yīng)用bFGF抗體使心功能進(jìn)一步受損，與I/R組比較，LV dp/dtmax分別低35.1%和38.1%(P0.01)，LVEDP高92.5%(P0.01), HRr/Hri低36.0%(P0.01)。應(yīng)用外源bFGF顯著改善I/R后受損的心功能，LV dp/dtmax較I/R組分別高42.8%和25.6%(P0.01),LVEDP低40.0%(P0.01), HRr/Hri高42.3%(P0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2所示。表2bFG

24、F及其抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注心臟心功能的影響 Tab 2The effect of bFGF and bFGF antiserum on myocardial function of rat isolated ischemia/reperfusion heart(s，n=6) GroupRHR(%)R+dp/dtmax(%)R-dp/dtmax(%)RLVEDP Control 88.94.1* 91.63.0* 91.45.4* 1.10.1* I/R48.910.653.34.454.87.32.00.3bFGF 69.611.1*76.06.6*68.86.8*1.20.1*Anti-b

25、FGF 31.35.6*34.65.4*33.96.0*3.70.6* * P0.01, vs I/R group；RHR: ratio of heart rate；R+dp/dt max: ratio of +dp/dtmax；R-dp/dtmax: ratio of -dp/dtmax；RLVEDP: ratio of LVEDP 三、 bFGF對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌PKC及MAPK活性的影響I/R組心肌PKC及MAPK活性較對(duì)照組分別高46.8%和6.2%(P0.01)；與I/R組比較，bFGF抗體組心肌PKC及MAPK活性分別低20.9%和7.7%(P0.01)，而給以外源bFGF后這

26、兩種蛋白激酶活性分別高41.3%和10.1%(P0.01)。結(jié)果見(jiàn)2。Fig 2The effect of bFGF and bFGF antiserum on PKC and MAPKactivity of rat ischemia/reperfusion myocardium(s,n=6)* P0.01, vs I/R group2bFGF及其抗體對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌PKC和MAPK活性的影響討論bFGF為體內(nèi)廣泛分布的一種多功能生長(zhǎng)因子，它對(duì)組織細(xì)胞的促絲裂作用已獲得公認(rèn)。近年來(lái)，該因子的非絲裂作用愈來(lái)愈引起人們的重視。有報(bào)道，bFGF可上調(diào)血管壁L-精氨酸/一氧化氮系統(tǒng)1，參與對(duì)血管

27、壁張力及血壓的調(diào)節(jié)2，并與體內(nèi)多種心血管活性肽形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，對(duì)細(xì)胞損傷具有明顯的拮抗作用。心肌缺血時(shí)可誘導(dǎo)bFGF的產(chǎn)生。Cohen等4發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎狗冠脈左前降枝2 h后，缺血心肌中bFGF活性即明顯增加，2周時(shí)達(dá)高峰。bFGF表達(dá)增加的遠(yuǎn)期效應(yīng)與缺血組織血管新生增強(qiáng)及促進(jìn)損傷組織的修復(fù)有關(guān)，但其急性效應(yīng)的作用及機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)在大鼠離體心臟缺血/再灌模型上發(fā)現(xiàn)，外源bFGF可顯著拮抗缺血/再灌注損傷，表現(xiàn)為 改善心功能，減少冠脈流出液中蛋白、肌紅蛋白含量及LDH活性，降低心肌組織MDA和鈣含量，增加心肌ATP含量；而使用bFGF抗體阻斷內(nèi)源性bFGF的作用后，心肌缺血/再灌注損傷進(jìn)一步

28、加重，心功能明顯惡化，心肌組織MDA及鈣含量顯著增高。表明bFGF為一內(nèi)源性保護(hù)因子。bFGF的生物學(xué)效應(yīng)通過(guò)其受體的功能實(shí)現(xiàn)，后者屬酪氨酸蛋白激酶受體，當(dāng)該因子與受體結(jié)合后，激活了蛋白激酶活性，引起細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白磷酸化，導(dǎo)致PKC、MAPK的激活，介導(dǎo)了信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)了bFGF的有關(guān)生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，外源bFGF顯著刺激了I/R心肌組織的PKC與MAPK活性，而使用bFGF抗體導(dǎo)致I/R心肌組織中這兩種激酶的活性較I/R組顯著降低。提示PKC和MAPK的激活與bFGF引起的對(duì)I/R心肌損傷的保護(hù)作用密切相關(guān)。我們認(rèn)為，bFGF對(duì)組織細(xì)胞的保護(hù)作用通過(guò)兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，一種是

29、間接作用，既通過(guò)擴(kuò)張血管及促進(jìn)血管新生10，增加缺血組織的血液供應(yīng)，改善細(xì)胞的功能與代謝狀態(tài)；另一種是直接作用。文獻(xiàn)報(bào)道，bFGF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的變性、損傷具有保護(hù)作用，并能保護(hù)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞免受H2O2或血清饑餓的損傷。我們?cè)谛募〖?xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)(資料另文報(bào)道)，bFGF可減輕缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷，而使用PKC阻斷劑H7或MAPK阻斷劑PD98059顯著抑制了bFGF對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的拮抗作用，進(jìn)一步說(shuō)明bFGF對(duì)細(xì)胞的直接保護(hù)作用的機(jī)理與激活心肌內(nèi)PKC、MAPK活性有關(guān)，詳細(xì)機(jī)制尚待深入探索。bFGF的細(xì)胞保護(hù)作用對(duì)缺血心肌的防治可能具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得

30、進(jìn)一步研究。基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.39730220)姜志勝（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）王曉紅（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）符民桂（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）趙文（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）李淑蓮（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）唐朝樞（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管病研究所， 北京 100034）參考文獻(xiàn)1姜志勝，王相智，龔曼麗，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)猴冠狀動(dòng)脈NO生成的影響J. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997,6:565.2姜志勝，蘇加林，李夏，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)左旋硝基精氨酸誘導(dǎo)的大鼠高血壓的影響J.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1999,19(2):157160.3姜志勝，李夏，陳魁，等.堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性家兔急性心肌梗塞的影響J.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，1997,5:126129.4Cohen MV, Vernon J, Yaghdjian V, et al. Longitudinal changes in myocardial basic fibroblast growth fac