1、多肽類藥物制劑研究現狀方宏清(軍事醫學科學院生物工程研究所北京100071摘要多肽類藥物制劑研究面臨的主要問題是多肽的穩定性不好、體內半衰期短和生物膜透過性差。本文綜述了多肽類藥物不穩定的原因;提高多肽穩定性的方法;多肽類藥物制劑貨架時間的確定;多肽類藥物的分析手段;多肽類藥物的控釋研究;多肽的非注射途徑給藥研究。最后還提出了多肽類藥物制劑研究的展望。關鍵詞多肽藥物制劑穩定性控制釋放非注射途徑給藥隨著生物技術的發展,多肽作為藥物在臨床上的應用越來越廣泛,相應的制劑學研究也日益受到重視。與傳統的小分子有機藥物相比,多肽具有穩定性差,體內半衰期短和不易通過生物膜等特點。本文從穩定性、緩釋系統、非注

2、射途徑給藥三方面對多肽類藥物制劑的研究概況進行介紹。1多肽的穩定性研究1.1引起多肽不穩定的原因13(1脫酰胺反應在脫酰胺反應中, Asn/Gln殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應與環境條件和多肽的結構有關。提高pH值、升高溫度都將有利于脫酰胺反應的進行。在-Asn-Gly-結構中的酰胺基團更易水解,位于分子表面的酰胺基團也比分子內部的酰胺基團易水解。(2氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種,一是溶液中有過氧化物的污染,二是多肽的自發氧化。在所有的氨基酸殘基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對氧化也都有影響。(3水解多肽中的肽鍵易水解

3、斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽鍵。(4形成錯誤的二硫鍵二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發生交換可形成錯誤的二硫鍵,導致三級結構改變和活性喪失。(5消旋除Gly外,所有氨基酸殘基的碳原子都是手性的,易在堿催化下發生消旋反應。其中Asp殘基最易發生消旋反應。(6-消除-消除是指氨基酸殘基中碳原子上基團的消除。Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等殘基都可通過-消除降解。在堿性p H 下易發生-消除,溫度和金屬離子對其也有影響。(7變性、吸附、聚集或沉淀變性一般都與三級結構以及二級結構的破壞有關。在變性狀態,多肽往往更易發生化學反應,活性難以

4、恢復。在多肽變性過程中,首先形成中間體。通常中間體的溶解度低,易于聚集,形成聚集體,進而形成肉眼可見的沉淀。蛋白質的表面吸附是其貯存、使用過程中遇到的另一個令人頭痛的問題,如r IL-2在進行灌注時會吸附在管道表面,造成活性損失4。1.2提高多肽穩定性的途徑1,3(1定點突變通過基因工程手段替換引起多肽不穩定的殘基或引入能增加多肽穩軍事醫學科學院青年科研基金資助項目定性的殘基,可提高多肽的穩定性。(2化學修飾多肽的化學修飾方法很多,研究最多的是PEG修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物,在體內可降解,無毒。PEG與多肽結合后能提高熱穩定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延長體內半衰期5。選擇合

5、適的修飾方法和控制修飾程度可保持或提高原生物活性。(3添加劑通過加入添加劑,如糖類、多元醇、明膠、氨基酸和某些鹽類,可以提高多肽的穩定性6。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質周圍,因而提高了多肽的穩定性。在凍干過程中,上述物質還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩定多肽的天然構象,而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度。此外表面活性劑如SDS、Tw een、Pluro-nic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4凍干多肽發生的一系列化學反應如脫酰胺、-消除、水解等都需要水參與,水還可以作為其它反應劑的流動相。另外,水含量降低可使多肽的變性溫度升高7。因此,凍干可提高多肽的穩定性。1.3多肽

6、類藥物制劑的存放時間測定對動力學行為符合Arrhenius公式的藥劑,可利用加速實驗確定存放時間,但要求反應活化能是獨立于溫度的常數。通常認為基于Arrhenius公式的穩定性預測不適于多肽制劑,這是因為在進行蛋白質藥物加速實驗時有三個問題難以解決:(1多肽的降解途徑較多,各途徑活化能不同,升高溫度會改變多肽降解的主要方式;(2溫度會改變多肽的構象,從而改變降解反應的活化能;(3對凍干制品,若實驗溫度高于玻璃化溫度(Tg,固體制劑將由玻璃態變為粘塑性狀態,化學反應速率將急劇增加,從高于Tg獲得的數據就不能外推到低于Tg時的情況。但是,如果能解決上述問題,利用加速實驗進行穩定性預測就可以成為評價

7、多肽藥物制劑的有效工具。Yo shio ka等人8通過加速實驗確定了六種多肽制劑在25存放的有效時間,結果表明與實測結果基本接近。這說明在一定條件下可用加速實驗估算多肽制劑的貨架時間,特別是在研究初期,用加速實驗可節省大量時間和物力。但是,最終貨架時間的確定還是需要采用留樣觀察法。1.4多肽類藥物制劑的分析手段多肽類藥物制劑研究常用的分析手段有:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、凝膠過濾層析法、反相液相層析法、紫外光譜法、熒光光譜法、紅外光譜法、圓二色性光譜法、量熱法以及生物活性測定法9。這里僅介紹藥物制劑研究中常用的一種方法量熱法(Calorimetry。量熱法是通過測定樣品在受

8、熱過程中的放熱和吸熱行為來研究樣品中各組份的相互作用及狀態變化的一種方法,常用的是差示掃描量熱法(Differentiat Sca nning Calo rim etry。該方法廣泛用于多肽的熱穩定性分析、各種添加劑對多肽結構的影響、多肽與配基之間的相互作用等研究,還用于測定凍干物品的玻璃化溫度和共熔點。例如, Chan等10用DSC研究了添加劑對rh DNase 溶液熱變性的影響。蛋白質濃度為10mg/ ml,掃描速率為1.2/min。測得rh DNase 在純水中的Tm=67.4,Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rh DNa se的熱穩定,加入Mg2+、M n2+則不利于rhDNa

9、se的穩定。當Ca Cl2濃度為20100mmol/L時,Tm=76. 4,Hm=2022J/g。Ca Cl2和乳糖對rh D-Nase的穩定有復合作用。同時加50mmol/L Ca Cl2和100mg/ml乳糖,可使rh DNase的Tm值提高到76.4,Hm值到21.9J/g。Chang等11用DSC測定了rh IL-lra制劑的玻璃化溫度、反玻璃化溫度和共熔點。冷凍蛋白制劑的各種物理變化,如玻璃化、反玻璃化和共熔都會影響凍干過程。根據測定結果,作者確定了凍干溫度和升溫速度,僅用6個小時就完成凍干過程。2多肽類藥物的緩釋制劑研究多肽類藥物在血液中的半衰期一般很短,靜脈注射后很快就被清除或降

10、解,因此需要經常給藥,給病人帶來較多不便。為了減少給藥次數可采用緩釋或控釋技術:(1在注射液中加入高分子聚合物(如透明質酸,提高粘度、延緩藥物擴散速度;(2將多肽包裹在脂質體中,使多肽從脂質體中緩慢釋放出來;(3將多肽包裹在固體微粒中,使多肽從微粒中緩慢釋放出來。在上述方法中研究最多的是微粒遞釋系統。適于制備微粒的生物可降解材料有:聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物(PLC A、聚己內酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯12。多肽的微囊大多采用聚酯材料,特別是用PLGA。PLGA微粒釋放蛋白質的典型曲線分三相:起始爆釋相、擴散控釋相和分解控釋相。起始爆釋是指位于微粒表面或近表面的蛋白質在

11、幾小時內的快速釋放。擴散控釋是蛋白質通過微粒中孔道擴散釋放。為了獲得連續釋放,擴散控釋相必須與分解控釋相重疊,聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白質連續釋放。而主要的困難是降低起始爆釋,增加藥物載量。已用該法制備了許多肽和多肽的微粒劑型,如LHRH、T RH、Insulin、GH、SOD、TN F、IFN、IL-2、EPO等。其中LHRH類似物leuprolide的微粒制劑可控制釋放藥物長達一個月,并于1988年首先在法國上市,隨后又在歐美40個國家上市,1993年起在我國銷售。美國Genetech公司的研究人員也成功地制備了連續釋放一個月的rh GH和IFN-微囊制劑13,14。3非注射給藥途徑

12、研究多肽類藥物分子量大,脂溶性差,難以透過生物膜,一般只能注射給藥。但注射給藥、尤其是那些需要頻繁給藥的藥物,對病人來說是極其不便的。因此有必要進行多肽的非注射給藥途徑研究。文獻報道的多肽非注射給藥研究途徑有:鼻腔、肺部、眼、舌下、口服、直腸、陰道、皮膚等,其中研究最多的是鼻腔給藥、肺部給藥和口服給藥。3.1鼻腔給藥鼻腔部位存在豐富的毛細血管和淋巴管,鼻腔上皮與血管壁緊密相連,上皮細胞間間隙較大,具有較高的滲透性,能避免肝臟的首過效應,鼻腔部位蛋白酶含量也比胃腸中少。低分子量的藥物極易被吸收進入血液循環。對分子量較大的多肽,如降鈣素、胰島素、G-CSF、EPO等,在合適的吸收促進劑幫助下,也可

13、被吸收,但生物利用度較低15。鼻腔給藥的方式有滴鼻給藥法和噴霧給藥法,采用后一方法可獲得相對較高的生物利用度。目前降鈣素(32肽已有鼻腔遞釋制劑在歐洲、日本及美國上市,盡管其絕對生物利用度不足1%。1990年在美國上市的Nafa relin (十肽鼻腔噴霧劑,其生物利用度也僅2. 8%。3.2肺部給藥人肺的吸附表面積有140m2,血流量達5000m l/min,蛋白酶活性相對于胃腸道較低,不存在肝臟首過效應。肺泡壁比毛細血管壁還要簿,通透性好。動物實驗表明一些多肽藥物經肺給藥后生物利用度相當高,可達20%50%。但某些多肽易被肺中蛋白酶降解,還有一些多肽在形成氣溶膠微粒時會變性。哪一種多肽適合

14、于經肺給藥需逐例分析研究。選用合適的給藥裝置將藥物輸送至肺泡組織是肺部釋藥的關鍵。粉霧劑將是肺部遞釋的主要劑型16。理想的粉霧劑應是:粉末處方組分在低流速和低壓力差時,大部分藥物粒子能夠解聚,進入粉霧氣流中;吸入裝置則易產生流速較高的湍流。目前多肽的肺部給藥還處在研究階段,除Pulm ozy me(作用于肺部外17,還沒有一種多肽藥物的肺部遞釋制劑上市。3.3口服給藥口服給藥是最受人們歡迎的給藥途徑,多肽類藥物也不例外。但是正常情況下,大多數肽類藥物很少或不能經胃腸道吸收。其原因主要有:(1多肽分子量大,脂溶性差,難以通過生物膜屏障;(2胃腸道中存在著大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽;(3吸

15、收后易被肝臟消除(首過效應;(4存在化學和構象不穩定問題。目前人們研究的重點放在克服前兩個障礙上,即如何提高多肽的生物膜透過性和抵抗蛋白酶降解這兩個方面18。使用吸收促進劑來提高生物膜通透性是目前研究中采用的主要方法。文獻報道的促進劑包括水楊酸、膽酸鹽、脂肪酸、螯合劑、酰基肉堿等。而Emisphere公司的研究人員在研究中發現某些氨基酸衍生物能夠促進降鈣素、干擾素和生長激素的口服吸收。大量研究還表明吸收促進劑具有多肽特異性。提高生物膜通透性的其它方法還有:(1將多肽與V B12連接,通過受體介導吸收;(2用脂肪酸修飾多肽,提高脂溶性。文獻報道的克服多肽口服吸收酶障的途徑有:(1用PEG修飾多肽

16、,抵抗酶解;(2使用酶抑制劑;(3應用微乳制劑;(4應用納粒(na no particle.制劑;(5應用生物粘附性顆粒。直徑為100nm的PLG納粒在腸道中能大部分被吸收19,突破酶障和膜障。美國藥物開發公司應用Technosphere技術制備降鈣素的口服制劑,在狗體內的絕對生物利用度達26%。除環孢菌(環肽外,至今還未見多肽口服制劑的臨床應用報道。據稱Cortecs公司的降鈣素口服制劑已進入期臨床研究,有望成為第一個真正的多肽口服制劑。此外,在多肽透皮給藥方面也有新進展。利用超聲技術可使皮膚上形成小孔,促進多肽透皮吸收20。結語多肽的不穩定性是其制劑研究中存在的主要問題之一,其原因較多。但

17、對某一個多肽藥物來說引起不穩定的主要原因并不多。詳細研究外界條件(如pH、溫度、光照、氧濃度等對多肽穩定性的影響有助于設計合理的制劑配方。盡管添加劑穩定多肽的機制還不十分清楚,使用添加劑仍是目前提高多肽制劑穩定性的主要手段之一。應用CD、DSC等分析手段可幫助快速篩選到合適的添加劑。應用微粒系統控制釋放多肽藥物是目前多肽緩釋研究中的方向之一。這方面研究的主要難點有:(1改善微粒制備方法,提高收率;(2解決微粒制備過程中多肽的穩定性;(3提高藥物載量;(4降低起始爆釋率,獲得藥物連續釋放。目前國外一些生物技術制藥公司與藥物控釋研究公司利用各自的優勢進行合作,研究開發進展較快。國內這方面研究也已開

18、始。近年來對多肽的非注射途徑給藥研究雖取得一些進展,但面臨的困難仍然很多。幾乎所有多肽藥物的粘膜傳遞都需要滲透促進劑,而其種類繁雜,存在的問題是如何降低其刺激作用以及長期使用是否影響上皮完整性。用微粒代替滲透促進劑也許是很有前景的口服給藥方法。目前,在克服滲透障和酶障方面雖取得了一些成績,但尚無突破性進展。另外,多肽的肝清除問題應該受到重視,弄清肝清除機制、結構與清除之間的關系將有助于實現多肽口服給藥的夢想。本文承蒙黃培堂研究員、于公義研究員和朱厚礎研究員審閱,謹此致謝。參考文獻1M a nning M C,Pa tel K,Bo rchardt RT.Sta bility o f pro t

19、ein pha rmaceuticals.Pharm Res,1989;6:9032Po wel M F.Peptide stability in aqueo us pa renter-al for mulations:predictio n of chemical stability based on prima ry sequence.AC S Symp Ser, 1994;567:1003Li S,Scho neich C,Bo rchardt RT.Chemical in-stability of pro tein phar maceuticals:mecha nisms o f ox

20、idatio n and str ategies fo r stabilizatio n.Biotechnol Bioeng,1995;48:4904T zannis S T,Hrushesky W J M,W ood P A,et al.Irr ev er sible inactiv atio n o f interleukin-2in a pump-based deliv ery envir onment.Proc N atl A-cad Sci USA,1996;93:54605M atsushima A,Koder a Y,Inada Y.Chemica l mo dificatio

21、n o f pro tein drug s with P EG de riv a-tiv es.Drug Delivery Syst,1995;10:56M anning M C,M atsuura JE,Kendrick BS,et al.Approaches fo r increasing the so lution stability o f pro teins.Biotechnol Bioeng,1995;48:5067Izutsu K,Y oshio ka S.Stabili zatio n o f pro tein pharmaceutica ls in f reeze dried

22、 fo rmulatio s.Drug Stability,1995,1:118Y oshio ka S,Aso Y,Izutsu K,et al.Applica tion o f accelera ted testing to sh elf-life prediction of co mmercial pr otein prepara tio ns.J Pharm Sci, 1994;83:4549J o nes A JS.A nalysis of polypeptides and pro-teins.Adv Drug Del Rev,1993;10:2910Chan H,An-Yeung

23、K,Go nda I.Effects o f addi-tiv es o n h ea t dena tur atio n of rhDN ase in solu-tions.Pharm Res,1996;13:75611Cha ng BS,Fisher N L.Dev elo pement o f an effi-cient sing le-step free ze-dr ying cycle fo r pro tein for mulations.Pharm Res,1995;12:83112Couv reur P,Puisieux F.N ano-a nd micr opar ticle

24、s for the deliv ery of polypeptides a nd pro teins.Adv Drug Del Rev,1993;10:14113Cleland JL,Duenas E T,Yang J,et a l.One mo nth co ntinuous release rh G H PL GA for mulations.Proc Int Sy mp Control Rel Bioact Mater,1995;22:51614Clela nd JL,Yang J.In vitr o r elease of bioactiv e rh IFN-fro m PL G A

25、mic rospheres.Proc Int Symp Control Rel Bioact Mater,1995;22:51815Shimo da N,M aita ni Y,M achida Y,e t al.Effects of dose,p H and o smo la rity o n intranasal a bso rp-tio n of rh EPO in r ats.B iol Pharm B ull,1995;18:73416金方.呼吸道給藥的新劑型粉霧劑.國外醫學藥學分冊1996;23:117Cippoa D,Go nda I,Shir e SJ.Cha racteriz

26、ing ofa ero so l of r hDNa se g enera ted by jet nebulizer.Pharm Res,1994;11:49118Fix JA.O ra l contr olled release technolog y fo r peptides:sta tus a nd future pr ospec ts.Pharm Res,1996;13:176019Chaco n M,Berg es L,M o lpecer es J,et al.O pti-mized pr epar atio n of P LG A micro spher es and na n

27、o pa rticles o ra l administra tio n.Int J Pharm, 1996;141:8120M itrag o tri S,Blankschtein D,Lange r R.Ultr a-so und-mediated tra nsdermal pro tein deliv ery.Science,1995;269:850Current Status of Study on the Preparations ofPolypeptide DrugFang H o ngqingInstitute of B iotechnology,Academy of Milit

28、ary Medical Sciences,Beijing100071AbstractPoly peptide drug s a re g enerally characterized by the chemical and phy sical in-stability,sho rt biological half-life,a nd poo r permea bility acro ss biological membrane,w hich a re the main problems facing to the pharmaceutical study.This paper review e

29、d the causes of the instability,the metho ds fo r increasing the stability,the determination o f the shelf-life,非肽類纖維蛋白原受體拮抗 劑的研究進展 21 the methods of analy sis o f poly pepti de pharmaceuti cals, and the st udy o n cont ro lled release and non -parenteral admi ni strati on o f polypepti de drugs. Th

30、e prospects of resea rch on the preparati ons of po lypeptide drug w ere present ed. Key Words Poly pepti eds Prepa ra tions of Drug St abilit y Co ntro lled release No npa -renteral admi nist ra tio n ( 收稿 : 1997-07-08 非肽類纖維蛋白原受體拮抗劑的研究進展 許天林華維一倪沛洲 (中國藥科大學新藥研究中心 南京 210009 摘 要 纖維蛋白原受體 拮抗劑能阻止通過 各種途徑激活的血 小板聚集 ,因 而可以有效地抑 制血栓的形成 。 本文綜述非肽類纖維蛋