1、    單細胞顯微切割術在霍奇金淋巴瘤中的應用        摘要目的:應用單細胞顯微切割技術分離和研究霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)瘤細胞,并檢測其是否存在人巨細胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染。方法:采用單細胞顯微切割技術從HL組織切片中獲得其瘤細胞Reed-Sternberg/Variant (RS/V)細胞，提取DNA后,利用PCR擴增HCMV立即早期基因片段。結果:單細胞顯微切割可將RS/V細胞從

2、HL淋巴組織中獨立分離出來，收集切割的瘤細胞可獲得用于PCR擴增的模板DNA，在13例HL石蠟組織切片中有4例經PCR擴增出149bp的目的片段。結論:單細胞顯微切割技術適用于HL瘤細胞研究;部分HL組織的RS/V細胞中存在HCMV感染。關鍵詞顯微切割； 霍奇金淋巴瘤； 巨細胞病毒感染； 聚合酶鏈式反應中分類號R733文獻標識碼A文章編號1001-7399（2000）04-0310-03Application of microdissection technique in the research of Hodgkin's lymphomaYan Qingguo, Huang Gaos

3、heng, Zhu Desheng, Wang Zhe(Dept of Pathol, Fourth Military Medical University, Xi'an710033)ABSTRACTPurposeTo isolate and study the neoplastic cells of Hodgkin's lymphoma by microdissection technique,and to make clear whether human cytomegalovirus exists in the neoplastic cells. MethodsMicro

4、dissection for getting Reed-Sternberg/Variant(RS/V) cells from sections of Hodgkin's lymphoma and PCR for amplificating fragments of immediately early gene in human cytomegalovirus were employed. ResultsRS/V cells can be separated from their surrounding cells in tissues of Hodgkin's lymphoma

5、 after microdissection,and template DNA can be extracted from the microdissected cells. Out of 13 cases of Hodgkin's lymphoma, the expected 149bp fragments of HCMV were detected by PCR in 4 cases. ConclusionMicrodissection technique can be used in analysis of neoplastic cells in Hodgkin's ly

6、mphoma. Human cytomegalovirus infection exists in RS/V cells in some cases of Hodgkin's lymphoma.KEY WORDSmicrodissection; Hodgkin's lymphoma; cytomegalovirus infections; polymerase chain reaction霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）是惡性淋巴瘤的一個獨特類型,其腫瘤異質性表現明顯,瘤組織成分多樣,特征性的瘤細胞(R-S細胞及其變異型)占細胞成分的1%以下,

7、且呈散在性分布,這為對其瘤細胞進行分析帶來一定困難,特別是在常規PCR檢測中,從組織中提取的DNA或RNA模板包含了來自R-S細胞及其變異型瘤細胞和來自淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、組織細胞等多種非瘤細胞成分,其結果不能反應腫瘤細胞的狀況。近年來的研究表明,單細胞顯微切割技術可特異地將欲研究的目的細胞從其它細胞中分離出來用于進一步分析。該方法特異性強, 并可將形態學與分子生物學方法很好地結合起來,特別適于腫瘤異質性的相關研究,其應用日益廣泛1。我們應用此技術結合PCR方法在HL瘤細胞中進行了人巨細胞病毒的檢測。1材料與方法1.1材料1.1.1標本13例HL患者淋巴結來自我校3個附

8、屬醫院病理科，淋巴結經常規福爾馬林固定、石蠟包埋，HE染色并經病理診斷證實。其中混合細胞型8例，結節硬化型4例，淋巴細胞消減型1例。1.1.2主要設備日本Narishige液壓顯微操作系統（Narishige Co,LTD），日本Olympus普通光學顯微鏡，PE-2400擴增儀購自美國PE公司。1.1.3主要試劑Taq DNA Polymerase為加拿大Sangon公司產品，礦物油及蛋白酶K為Sigma公司產品。1.1.4引物PCR引物根據HCMV立即早期第四外顯子設計，上游引物：5'-GTACTGGGCAAAGACCTTCA-3'；下游引物：5'-TAAGTGAG

9、TTCTGTCGGGTG-3'。擴增片段長度為149 bp。1.2方法1.2.1待切割組織片的制備經10%福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊依病理學常規方法制備7 m連續切片，貼于載玻片置烤片機上70烤2 h，依下列步驟處理后不封片用于顯微切割：二甲苯浸泡2次，5min/次，100%、95%、80%、70%乙醇及去離子水各2 min，10滴蘇木精染液1 min后置于去離子水洗，5滴返藍液（0.2% Na2CO3,0.04% Li2CO3）5 min后去離子水洗；10滴伊紅染液1 min后去離子水洗；甘油緩沖液（2.5% glycerol; 0.05 mol/L Tris/HCl,pH 8.

10、9;2 mmol/L EDTA;1 mmol/L NaCl）2 min后冷風機吹干。1.2.2顯微切割根據Moskaluk等2介紹的方法并作部分改進，將直徑0.5 mm的空心玻璃微管先用顯微操縱系統中的拉針器制成用于切割細胞和吸取細胞兩種類型尖端大小不同的玻璃針，切割用針尖端約1 m，吸取用針尖端約10 m；將與顯微操縱機械手通過液壓相連的持針器固定于顯微鏡操作平臺，再將玻璃針固定于持針器，玻璃針尾部與充滿礦物油的摸針器相連。在顯微鏡下找到待切割細胞的視野后，滴加去離子水，在x、y、z軸3個方向上精巧控制顯微操縱機械手，用切割針將切割的細胞與周圍細胞分割開，使其游離聚集，再用吸取針吸取并吹打入

11、EP管中。1.2.3DNA提取將含切割的RS/V細胞的EP管12.000 g離心，每10個細胞加入5 l TK消化液（0.5% Tween 20,0.02%蛋白酶K），Vortex混勻后短暫離心，置55水浴過夜；再置100烤箱中烤10 min；Vortex混勻后短暫離心供PCR用。1.2.4PCR擴增及產物鑒定PCR反應總體積為50 l，循環參數為：95 5 min;94 1 min,52.5 1.5 min,72 1.5 min,35個循環；72延伸10 min。在PCR反應中設立用去離子水替代擴增模板的陰性對照及用人HCMV立即早期基因為擴增模板的陽性對照。擴增產物以2%瓊脂糖電泳檢測。2

12、結果通過顯微操縱系統精細控制下的單細胞顯微切割，可將R-S及其變異型細胞同周圍的非瘤細胞精確分離。13顯示了單個R-S細胞變異型陷窩細胞在顯微切割前后的狀況。在13例福爾馬林固定石蠟包埋的HL組織切片中，用顯微切割技術每例獲得1530個不等的單個R-S或其變異型細胞用于PCR擴增，所收集細胞經采用蛋白酶K消化，100 10 min滅活蛋白酶K后獲得的DNA模板行PCR擴增，2%瓊脂糖電泳檢測，結果在13例中有4例擴增出預期的149 bp片段，其中3例為混合細胞型，1例為結節硬化型，陽性對照和陰性對照結果明確（4）。3討論顯微切割技術在生物學研究中的應用經歷了顯微組織切割、細胞群切割、單個細胞切

13、割、單細胞內組分切割、染色體切割等階段，隨著技術方法的不斷改進，顯微切割的區域不斷變小，而應用的領域則不斷擴大1。目前應用最為廣泛的是旨在分離單個細胞的單細胞顯微切割，該技術具有其獨特的優勢，它一方面可在細胞層次上使研究定位清楚，排除周圍其它細胞在分析中的干擾，另一方面又可與分子克隆、PCR、免疫組織化學等多種分子生物學和免疫學的研究方法相結合，而且研究取材廣泛，培養細胞、常規制備的染色體、石蠟切片、冷凍切片、細胞鋪片等均可采用，因此其應用十分廣泛。目前在新基因的發現、基因突變研究、染色體畸變、細胞局部病變病因學研究等多種領域均有研究應用3,4。1陷窩細胞（）顯微切割前。×4002陷

14、窩細胞（）顯微切割中。×4003顯微切割后陷窩細胞被去除（）。×4004RS/V細胞顯微切割后HCMV的PCR檢測結果1：123 bp 梯度Marker; 2:陽性對照；3：陰性對照； 416 ：13例檢測樣本，其中4、5、8、9擴增出149 bp HCMV片段單細胞顯微切割的具體方式有多種,各具特色,不同實驗室可根據各自條件進行選擇。Lee等1所報道的采用30G1/2注射用針替代需要專用拉絲設備制作的玻璃微針,再利用普通光學顯微鏡的微調旋鈕控制切割單個細胞,此方法簡單易行、低耗,尤其適合基層，但切割精度的控制較低；采用液壓式顯微操縱系統配合倒置顯微鏡進行顯微切割是很多實驗

15、室常用的方法2。本研究即根據此方法進行適當改進而來的，它可以利用一些實驗室原有的顯微操作裝置,但不能自動化,要收集較大量細胞時耗時長；激光捕獲式顯微切割是目前最為先進的方法,它快速方便,可從大量的研究材料中迅速捕獲較多的目的細胞,自動化程度高,但這需要昂貴的專用設備3。單細胞顯微切割用于基因組DNA分析所需的單個細胞數，依研究目的、切割組織的固定方式而有差異，Dietmaier等5比較了用流式細胞儀分選細胞和用顯微切割從冰凍切片和石蠟切片上切割單個細胞用于突變分析所需的最少細胞數，結果冰凍切片與流式細胞儀相同，至少需要10個細胞，而石蠟切片一般需要30個細胞。因不同組織類型的HL瘤細胞數差異較

16、大，本研究中每例獲得了1530個不等的單個瘤細胞用于PCR分析，其中4例PCR陽性所獲細胞分別是18、25、26、28個；此外，切片厚度也是影響單細胞顯微切割分析的一個因素，在不影響形態觀察的前提下，作為顯微切割的組織切片越厚越好，本研究中我們在7 m的連續石蠟切片上進行單細胞切割，獲取滿意結果。在HL的病因研究中，從瘤細胞中直接檢測出致病因子是十分重要的,最近我室利用PCR和原位雜交的方法直接檢測到在HL淋巴組織中存在HCMV的感染6。為進一步明確瘤細胞中是否存在HCMV的感染,我們又采用單細胞顯微切割技術進行了深入分析。從結果看,采用液壓式顯微操縱系統可以方便地將R-S及其變異型細胞與其它

17、非瘤細胞分離,切割下來的R-S及其變異型細胞用于PCR分析,在13例中有4例擴增出預期的149 bp片段，其結果表明在HL瘤細胞中確實存在HCMV感染。綜上所述,單細胞顯微切割技術可從多種細胞類型的組織中獲得單一的細胞類型,用于針對該型細胞的特異性分子生物學分析,從而將形態學與分子生物學相結合,已成為對腫瘤細胞進行研究的一個重要工具。基金項目：全軍醫藥衛生科研基金（No 98D046）和陜西省自然科學基金(No 98M38)資助課題作者簡介：閆慶國，男，31歲，博士。研究方向：淋巴造血組織腫瘤閆慶國(第四軍醫大學病理學教研室)黃高?(第四軍醫大學病理學教研室)朱德生(實驗動物研究中心， 西安7

18、10033)王哲(第四軍醫大學病理學教研室)參考文獻1，Lee JY,Dong SM,Kim SY et al. A simple,precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections. Virchows Arch, 1998;433(4):3053092，Moskaluk CA,Kern SE. Microdissection and polymerase chain reaction amplification of genomic DNA from histological tissu