1、兒童急性白血病生存素和細胞周期素B1基因表達    【關鍵詞】  生存素基因；細胞周期素B1基因；急性白血病；逆轉錄聚合酶鏈反應      Expressions of survivin and cyclin B1 gene in childhood acute leukemia    【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and significance of survivin and cyclin B1 g

2、ene in childhood acute leukemia (AL). METHODS: The expressions of survivin and cyclin B1 gene were examined by RTPCR in bone marrow cells from 42 children with incipient or relapsed AL， 13 with completely remissive AL (ALCR) and 15 without malignant disease as a control group. RESULTS: In incipient

3、and relapsed AL groups, the expression level of survivin were 0.472 and 0.810, cyclin B1 were 0.606 and 0.739, which were remarkably higher than those in control group and ALCR group (P<0.01). There was a significantly difference between incipient AL group and relapsed AL group in the expression

4、level of survivin mRNA (P=0.025). The expression of survivin gene was associated with initial white blood cell (WBC) count and clinical types of AL. The expression of cyclin B1 gene was not correlated with age, sex, immunogenic type, initial WBC count and clinical types of AL. There was a significan

5、tly positive correlation between the expression of survivin gene and cyclin B1 in Childhood AL (r=0.6864, P<0.01). Patients with high survivin expression level achieved a lower rate of complete remission (CR) than those with low expression level of survivin. CONCLUSION： Survivin and cyclin B1 gen

6、e are expressed widely in specimens of AL, and there is a positive correlation between them. Overexpression of survivin may imply the lower sensitivity of the leukemic cells to chemotherapy and the higher risk of relapse. Overexpression of survivin might be an index of treatment effect, and might be

7、 related to poor prognosis.    【Keywords】 survivin;  cyclin B1;  acute leukemia;  reverse transcriptionpolymerase chain reaction    【摘要】 目的： 探討基因生存素，細胞周期素B1的表達與兒童急性白血病（AL）的關系. 方法：采用RTPCR對初治或復發AL患兒42例和完全緩解AL(ALCR)患兒13例及非惡性疾病患兒15例骨髓單個核細胞進行基因生存素，細胞周期素B1表達的檢測

8、. 結果：初治和復發AL組生存素 mRNA表達水平分別為0.472和0.810，細胞周期素B1 mRNA為0.609和0.739，均高于ALCR組（0）和對照組（0）（P<0.01）；復發AL組生存素 mRNA表達水平高于初治組，有統計學差異（P=0.025）. 生存素基因的表達與白細胞總數及臨床分型有關，與性別、年齡、免疫分型無明顯相關性. 細胞周期素B1表達與性別、年齡、免疫分型、白細胞總數及臨床分型無明顯相關關系. 兒童AL中生存素與細胞周期素B1的表達呈正相關. 生存素 mRNA表達水平高者緩解率低. 結論：兒童AL中存在生存素，細胞周期素B1異常表達，兩者表達存在相關性. 生存

9、素是AL復發的高危因素；AL 生存素高表達者可以降低AL的化療敏感性，生存素水平對AL有判斷療效和預后的價值.    【關鍵詞】 生存素基因；細胞周期素B1基因；急性白血病；逆轉錄聚合酶鏈反應      凋亡相關基因與白血病的治療及耐藥有關. 生存素是一種凋亡抑制蛋白，與腫瘤發生有密切關系1. 細胞周期素B1是細胞周期調節因子，它的異常表達將導致細胞周期發生紊亂，致使腫瘤形成. 我們采用逆轉錄多聚酶鏈式反應(RTPCR)的方法對初治、復發、化療后達完全緩解的急性白血病(acute leukemia, AL)患兒以及

10、對照組骨髓單個核細胞生存素基因的表達進行了檢測，以探討生存素和細胞周期素B1基因與兒童急性白血病的關系及其臨床意義.    1對象和方法    1.1對象200402/200411 AL患兒55（男36，女19）例，年齡214歲. 其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 43例(L1 4例，L2 36例，L3 3例)，急性非淋巴細胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia, ANLL) 12例(M2a 6例，M2b 1例，M3a 3例，M3b 1例，M4b

11、 1例). 初治35例，完全緩解(ALCR) 13例，復發7例. 初治組中ALL 26例，其中BALL 16例，TALL 5例，5例未進行免疫分型，ANLL 9例. 各組性別、年齡等條件相似. 對照組15（男9，女6）例，年齡314歲. 為同期住院非惡性血液病（特發性血小板減少性紫癜、缺鐵性貧血等）患兒.    1.2方法Trizol試劑（Gibco公司）；逆轉錄酶MMLV(Promega公司)，Taq酶（Sangon公司）；PCR擴增儀（MJ公司220型）. 抽取患者骨髓液12 mL，ACD抗凝，采用Ficoll密度梯度離心分離出單個核細胞(mononuclei

12、c cell, MNC)，采用Trizol試劑抽提并制備總RNA. cDNA的合成包括總RNA 2 L (1 g/L), oligo(dT)18 1.0 L，加ddH20至12 L，70反應5 min，冰上冷卻，加入5×Buffer 4.0 L，RNasin核糖核酸酶抑制物1.0 L，10 mmol/L的dNTPs 2.0 L，37反應5 min，加MMuLV逆轉錄酶(200 MU/L) 1.0 L，終體積20 L，42反應60 min，70反應10 min后冰上冷卻完成反應. PCR擴增  生存素上游引物：5ACCGCATCTCTACATTCAAG3，生存素下游引物：5C

13、TTTCTTCGCAGTTTCCTC3；細胞周期素B1上游引物： 5CCATTATTGATCGGTTCATGCAGA3，細胞周期素B1下游引物： 5CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA3；actin上游引物：5AAGAGAGGCATCCTCACCCT3，actin下游引物：5TACATGGCTGGGGTGTTGAA3. 生存素擴增產物長度342 bp，細胞周期素B1擴增產物長度585 bp，actin擴增產物長度218 bp. PCR反應體系為25 L，包括逆轉錄產物cDNA 2 L，10×PCR反應緩沖液2.50 L，10 mmol dNTP 0.5 L，25 mmol

14、/L MgCl2 1.5 L，生存素（或細胞周期素B1）上、下游引物,actin上、下游引物各1.0 L（10 mol/L），Taq DNA聚合酶(83.35 mkat/L) 0.2 L，其余用水補足. 生存素反應條件為：94 30 s，54 30 s，74 40 s，30個循環. 細胞周期素B1反應條件為：94 60 s，54.7 60 s，74 40 s，32個循環. 取擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，有目的基因擴增片斷特異性條帶者的為陽性，以無模板的PCR產物為陰性對照. 利用Gel Doc 2000系統對凝膠圖像進行分析，計算樣本生存素，細胞周期素B1基因PCR產物條帶光密度與actin

15、PCR產物條帶光密度比值，即為生存素，細胞周期素B1基因表達水平.    統計學處理：使用SPSS 10.0軟件包處理. 生存素，細胞周期素B1基因的表達數據用中位數(P25P75)表示，組間比較進行秩和檢驗，對列聯表資料進行相關分析，檢驗水準=0.05.    2結果    2.1生存素，細胞周期素B1 mRNA的表達初治和復發組表達均高于對照組；緩解組和對照組表達無差異；復發組生存素表達高于初治組（圖1,2），復發組細胞周期素B1表達和初治組間無差異（表1）. ANLL患者生存素 mRNA表達中位數為

16、0.536，ALL為0.450，兩者比較無顯著性差異（P=0.853）. ANLL 細胞周期素B1 mRNA表達中位數為0.606，ALL為0.592，兩者的表達水平無統計學差異（P=0.590）.表1兒童白血病生存素，細胞周期素B1 mRNA的表達比較    2.2生存素，細胞周期素B1 mRNA表達與臨床特征初治AL組中生存素mRNA在WBC50×109/患者表達水平為0.748，在WBC<50×109/患者為0.442，兩者差異有顯著意義（P=0.019）. 高危型患者生存素 mRNA表達水平為0.699，低危型患者為0.433，兩

17、者差異有顯著意義（P=0.010）. 細胞周期素B1 mRNA表達在高危型和低危型患兒間、在WBC50×109/和WBC<50×109/患兒間差異無顯著性；生存素，細胞周期素B1 mRNA在年齡10歲或<1歲與110歲患兒之間差異無顯著性；在男女間差異無顯著性；在TALL和BALL兩者差異無顯著性（表2）. 對初治35例AL患者的生存素和細胞周期素B1 mRNA表達進行相關分析，發現兩者的mRNA表達成正相關（r0.6864，P<0.01，表3）. 35例初治AL患者中13例可進行療效評估（2例早期死亡，20例未治療）. 10例獲得完全緩解（complet

18、e remission, CR）. 獲得CR的患兒化療前生存素 mRNA表達中位數為0.473，細胞周期素B1 mRNA表達中位數為0.677，而未獲得CR的患兒化療前生存素 mRNA表達中位數為0.810，細胞周期素B1 mRNA表達中位數為0.606. 提示生存素 mRNA表達高的患者化療療效差、不易達到CR.，但尚需進一步積累病例，以便分析生存素 mRNA表達水平與急性白血病類型、療效的關系. 7例復發的AL患者，只有2例用化療藥后達到CR，其生存素，細胞周期素B1 mRNA表達均陽性. 余5例均未達到CR.表2兒童白血病生存素，細胞周期素B1的表達與臨床特征的關系百事通  &

19、#160;  3討論    腫瘤的發生是一個多因素多階段相互作用的過程，細胞增殖與細胞凋亡的失衡是腫瘤發生的重要機制. 生存素基因表達水平與細胞凋亡間存在明顯的負相關2. 我們發現初治AL組和復發AL組中細胞普遍表達生存素基因，比完全緩解組和對照組骨髓細胞的表達明顯增高(P<0.01)，完全緩解組生存素基因的表達與對照組無差異，提示AL中生存素基因的表達可能阻礙了細胞的凋亡，延長了細胞的生存時間，使白血病細胞在體內呈蓄積性增加，亦即兒童急性白血病的發生可能與抑制凋亡基因生存素的高表達有關. 生存素基因不僅與腫瘤發生有關，而且與腫瘤耐藥、腫瘤預后不良

20、也有關3-6. 我們的實驗結果顯示，復發組的生存素基因表達水平明顯高于初治組(P<0.01)；高危組AL患者的生存素基因表達水平明顯高于低危組AL患者，差異顯著（P<0.05）；在臨床療效比較中生存素高表達者臨床完全緩解率低于低表達者. 提示生存素基因可能是兒童AL的一個高危因素，高表達生存素基因者易復發，臨床預后差，說明生存素異常表達影響腫瘤細胞臨床藥物的耐受. Takeno等7認為細胞周期素B1是食管癌預后不良的指標. 馬衛東等8發現細胞周期素B1高表達者的無病生存率高于正常表達者，說明細胞周期素B1高表達對患者預后有積極意義，可作為預后較好的標志. 本研究表明AL細胞普遍表達

21、細胞周期素B1基因，比完全緩解組和對照組骨髓細胞的表達明顯增高(P<0.01)，完全緩解組的表達與對照組無差異，復發組表達水平與初治組之間、高危組與低危組之間均無顯著差異(P>0.05). 提示兒童急性白血病的發生可能與細胞周期素B1表達有關.    【參考文獻】    1 劉江偉,李開宗,竇科峰,等.胰腺癌組織survivin和COX2表達的相關性J.第四軍醫大學學報,2004,25(7):635-636.    2  Morinaga S, Nakamura Y, Ishiwa

22、N, et al. Expression of survivin mRNA associates with apoptosis, proliferation and histologically aggressive features in hepatocellular carcinomaJ. Oncol Rep, 2004，12(6):1189-1194.    3 Chakravarti A, Zhai GG, Zhang M, et al. Survivin enhances radiation resistance in primary human glioblastoma cells via caspaseindependent mechanismsJ. Oncogene, 2004，23(45) :7494-7506.    4 Kami K, Doi R, Koizumi M