1、    反義單核細胞趨化蛋白-1轉基因表達對單核細胞在動脈內膜粘附的影響        【摘要】目的了解動脈粥樣硬化發病過程中單核細胞粘附并進入動脈內膜的機制，分析單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因表達對單核細胞粘附動脈內膜的作用。方法以實驗性高脂血及輕度氧化LDL（MM-LDL）局部保留灌注的家兔股動脈為模型，采用DOTAP陽離子脂質體包裹LNCX-anti-MCP-1質粒，將反義MCP-1 cDNA定位導入家兔股動脈鞘及周圍組織，以原位雜交、 Northern雜交及狹

2、縫雜交法觀察反義MCP-1基因的表達，應用掃描電鏡觀察單核細胞在動脈內膜粘附的情況。結果PCR檢測發現重組基因的整合，RNA水平的檢測發現實驗組有反義MCP-1 mRNA的表達，且實驗組正義MCP-1 mRNA的表達量比對照組減少，對照組可見明顯的單核細胞粘附，實驗組則未見此現象。結論用逆轉錄病毒表達載體-陽離子脂質體介導的反義MCP-1轉基因表達能減少靶基因表達并抑制單核細胞在動脈內膜粘附，為動脈粥樣硬化防治提供了一個新的研究線索。【關鍵詞】單核細胞；單核細胞化學吸引蛋白質1；RNA，反義；內皮，血管 Inhibition of monocytes adhesion to the intim

3、a of arterial wall by local expression of antisense monocyte chemotactic protein-1WU Qiang, QIAO Huihong, WANG Zongli, ZHANG Hua,LIU Peimao, XU Man, REN Guofeng, ZHAO Sanmei, SHE Mingpeng(Institute of Basic Medical Science, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijin

4、g 100005, China)【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of monocyte recruitment in atherogenesis and to clarify the effect of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in this process. MethodsFemoral arteries isolated from the rabbits which had been fed with a high cholesterol diet and locally perfus

5、ed with MM-LDL within the artery beforehand, were used as the models. Antisense MCP-1cDNA was transferred into the arterial wall by injecting recombinant LNCX-anti-MCP-1/liposomal complex in the femoral sheath and the periarterial tissue. ResultsExpression of antisense MCP-1 mediated by recombinant

6、LNCX plasmid/lipsomal complex gene transfer enabled to inhibit MCP-1 gene expression and adhesion of monocyte to the intima. ConclusionMCP-1 plays an important role on the recruitment of monocytes in the arterial wall, which provides a potential clue in developing a gene therapy project for the prev

7、ention and treatment of atherogenesis.【Key words】Monocytes;Monocyte chemoattractant protein-1;RNA,antisense;Endothelium,vascular單核細胞粘附進入內皮下間隙，吞噬脂質形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化早期的病理表現。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）是一個作用極強的單核細胞趨化因子，不僅具有吸引單核細胞移動的功能，而且對血管內皮細胞粘附分子的表達亦具有調節作用1-3，在動脈粥樣硬化的發生發展過程中具有重要作用，但目前

8、對其在體內的作用及機制尚未完全了解。我們將反義MCP-1 cDNA重組表達質粒定位導入家兔股動脈鞘及動脈周圍組織，觀察反義MCP-1基因表達對MCP-1 mRNA表達的抑制作用，及其對單核細胞粘附進入動脈內膜的影響。材料和方法1質粒、菌株、引物：含有MCP-1 cDNA的pBluescript質粒由美國國家腫瘤研究所Yoshimura博士惠贈。逆轉錄病毒表達載體LNCX-anti-MCP-1質粒由本室構建4。PCR引物：P1 5-CGTGTGTTCTTGGGT-TGTGG-3；P2 5-CAGGTGGGGTCTTTCATTCC-3由美國Cybersyn生物工程公司協助設計并合成。2試劑和探針：

9、二油酰氧丙基-三甲基氨硫酸鹽(DOTAP)陽離子脂質體購自Boehringer Mannheim公司，總RNA、DNA提取試劑盒購自Promega公司。32P標記正義及反義RNA探針用pBluescript-Sk/MCP-1cDNA質粒,按Promega公司RNA探針體外合成系統藥盒操作手冊合成。3DOTAP脂質體/DNA的制備：溶液A：羥乙基派嗪- 乙基磺酸緩沖液(HBS:20 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, pH 7.4)稀釋LNCX-anti-MCP-1超螺旋質粒DNA至終濃度30 g/ml，溶液B：羥乙基派嗪- 乙基磺酸緩沖液稀釋DOTAP至終濃度80 g

10、/ml, 輕輕將兩種溶液混合，室溫放置15 min。4輕度氧化低密度脂蛋白（MM-LDL）的制備：密度梯度超速離心法提取低密度脂蛋白，按文獻5方法用含Fe2SO4的PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）攪拌透析60 h制備并鑒定。5動物：新西蘭大耳白兔，雄性，體重2.5 kg, 購自衛生部生物制品檢定所。6慢性動物實驗：取8只血清總膽固醇處于0.91 mmol/L的新西蘭大耳白兔，任選2只做為實驗組，用25%烏拉坦麻醉(1 g/kg體重)后，按Rios等6的方法手術分離暴露兩側股動脈鞘，在鞘內注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1質粒300 l（含DNA 10 g），鄰近股動脈

11、周圍組織中注射生理鹽水稀釋的上述質粒500 l（含DNA 100 g），對照組注射等分子量的LNCX載體質粒,縫合傷口，以1.01.5 g.kg-1.d-1給動物喂食膽固醇20 d后，當每只兔的血膽固醇濃度達26 mmol/L左右取材，檢測局部股動脈及周圍組織中重組基因的整合、表達，掃描電鏡觀察股動脈內膜單核細胞的粘附。7急性動物實驗：術前3 d每只兔的左腹股溝處局部肌注丁哌卡因9 mg。實驗兔麻醉后手術分離暴露約4 cm長一段股動脈，結扎其分支，用動脈夾夾住兩端。用注射器以肝素生理鹽水沖洗后,灌注 MM-LDL(600 mg/ml)至股動脈完全被MM-LDL充盈后，阻斷遠側端，保留灌注 2

12、h后恢復血流，在右側股動脈鞘內注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1質粒DNA，周圍肌肉注射生理鹽水稀釋的質粒DNA，用量與慢性實驗相同6。術后2 d取材,檢測局部股動脈中重組基因的整合表達,觀察動脈內膜單核細胞的粘附7。8原位雜交：冷凍切片經RNase、蛋白酶K處理，經預雜交后，加入-32P-CTP 標記的正義MCP-1 RNA探針，其放射活性為5×104 min/m，濕盒中保溫，沖洗切片后涂布11稀釋的核4乳膠（中國科學院高能原子研究所），置密閉暗盒中-20 曝光3 d，顯影定影后HE染色7。9狹縫雜交及Northern雜交：參照文獻8進行，提取的總RNA經電泳和紫外

13、分光光度法檢測純度，嚴格定量每份樣品上樣量為25 g。狹縫雜交為比較實驗組與對照組正義MCP-1 mRNA表達量的差別，以反義MCP-1 mRNA為探針與提取的組織總RNA雜交，放射自顯影后成像，經UVI像分析儀掃描，比較每組條帶掃描所得吸光度值（A）的平均數。10掃描電鏡標本制備：將股動脈縱行剖開，鋪平、沖洗后用2.5%戊二醛4下固定2 h，PBS漂洗，1%鋨酸后固定2 h，經梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯浸泡過夜后，浸入六-甲基-二硅胺烷3 min，噴金。掃描電鏡觀察血管內膜表面。結果1重組基因轉染后LNCX-anti-MCP-1在股動脈整合情況的檢測：用與載體序列互補的P1和與MCP-1序列互

14、補的P2為引物，以提取的股動脈組織基因組DNA為模板進行PCR反應，實驗組及陽性對照組皆擴增出特異片段(415 bp)，對照組則未見此片段。2重組基因轉基因后反義MCP-1 mRNA在股動脈表達情況的檢測：（1）原位雜交：用正義MCP-1 mRNA探針進行組織切片原位雜交，結果顯示，實驗組動物經重組基因轉基因后股動脈壁內側肌層平滑肌細胞有反義MCP-1 mRNA 的表達(1)。（2）Northern 雜交： 實驗組皆檢測到了反義MCP-1mRNA的表達，對照組則未測到反義MCP-1 mRNA的表達(2)。（3）狹縫雜交：急慢性實驗的實驗組MCP-1 mRNA的表達都有所減少，其中慢性實驗實驗組

15、股動脈中MCP-1 mRNA的表達量都比對照組少（3）。以GAPDH cDNA為探針與提取的mRNA進行狹縫雜交，結果表明反義重組基因轉染不影響GAPDH的表達。1實驗組動物經重組基因轉染后股動脈平滑肌細胞有反義MCP-1表達原位雜交×1 0001、4：慢性實驗重組基因轉染實驗；2、3：急慢性實驗對照組；57：急性實驗重組基因轉染實驗組2用正義MCP-1 RNA探針進行Northem雜交分析重組基因轉染后反義MCP-1 mRNA的結果1：急性實驗對照組；2：急性實驗實驗組；3：慢性實驗對照組；4：慢性實驗實驗組3反義RNA探針進行狹縫雜交分析實驗動物股動脈MCP-1 mRNA表達結果

16、3單核細胞對血管內皮的粘附情況：用掃描電鏡觀察可見急性及慢性實驗對照組的股動脈內膜表面皆有明顯的單核細胞粘附，平均每個高倍視野（×1 000）中可見35個成堆或散在的單核細胞粘附，但轉基因實驗組各動脈的股動脈內膜未見單核細胞粘附（47）。4急性實驗重組基因轉染組家兔股動脈內膜，經MM-LDL刺激后，在多數連續觀察的視野中沒有單核細胞粘附×1 5005急性實驗對照組股動脈內膜經MM-LDL刺激作用后有成堆的單核細胞粘附×3 0006慢性實驗對照組家兔股動脈內膜，在慢性實驗性高脂血情況下，可見散在的單核細胞粘附在動脈內膜×1 300(左側為同一細胞的高倍放大

17、×10 000)7慢性實驗重組基因轉染組股動脈內膜，在慢性實驗性高脂血情況下，未見單核細胞粘附×1 190討論單核-巨噬細胞首先進入動脈內膜并在內皮下形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化最早期的病理形態學特點，繼之則發生中膜平滑肌細胞（SMC）向內膜的移動和增生。同時大量的研究（包括人體和動物實驗材料）表明，在冠狀動脈成形術后動脈再狹窄，搭橋手術后血管的再狹窄和在移植心臟冠狀動脈中發生的以大量單核細胞浸潤為特征的快發性冠狀動脈閉塞的過程中均首先發生單核細胞的浸潤（伴有手術創面的血小板粘附或血栓形成）。單核細胞作為人體的清道夫細胞，在動脈內膜受損部位通過清除有害因子（如過氧化脂質及其他

18、致病物質）等對機體具有重要的保護作用，但單核-巨噬細胞是一種多功能的分泌和免疫活性細胞，巨噬細胞在進行吞噬等功能活動時可釋放一系列細胞因子和其他各種活性物質。如：血小板源生長因子（PDGF），干擾素（INF），轉化生長因子（TGF-），白細胞介素（IL）-1等9，10。體外實驗證明這些因子除可促進SMC增生和吞噬脂質外，可刺激或誘導血管壁其他細胞（如內皮細胞、SMC）相關基因的表達，形成細胞因子瀑布反應，而進一步加劇內膜損傷、SMC移動增生等10，11。因此，防止巨噬細胞進入動脈，抑制細胞因子瀑布反應將對動脈粥樣硬化的防治具有重要意義。Schwartz等12證明MCP-1為作用很強的單核細胞趨

19、化因子，且有調節血管內皮細胞表達相關粘附分子的作用,顯示其具有調節單核細胞粘附及進入動脈壁的雙重功能，在單核細胞粘附進入動脈內膜過程中具有十分重要的作用。雖然近年的大量研究發現許多物質，如：IL-8、PDGF、IL-1、凝血酶、TXA2等均與單核細胞進入動脈內膜有關，但其中MCP-1被認為是最重要的，Navab等13用單克隆抗體進行的阻斷實驗表明，在血管壁細胞分泌的單核細胞趨化物質中MCP-1起最重要的作用。目前已設計出許多將基因定位導入特定節段的血管壁的有效方法14，我們按照Rios等6的方法用脂質體包裹重組逆轉錄病毒的方法將反義MCP-1基因導入兔股動脈鞘及周圍組織，觀察到重組反義基因可在

20、動脈壁表達反義MCP-1，并對動脈壁自身的MCP-1 mRNA及單核細胞在動脈內膜上的粘附有抑制作用。表明用逆轉錄病毒表達載體-陽離子脂質體介導的反義MCP-1重組基因的轉基因表達能阻斷或減少靶基因表達并產生相應的生物學效應,為動脈粥樣硬化防治中可能應用的基因治療方案提供了新的線索。（本文編輯：常秀青）基金項目：國家自然科學基金資助項目(39570287)通信作者：王宗立作者單位：吳強（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）喬繪（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）紅王宗立（100005 北京，中國協和醫科大

21、學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）張華（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）劉佩毛（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）許漫（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）任國鋒（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）趙三妹（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）佘銘鵬（100005 北京，中國協和醫科大學 中國醫學科學院基礎醫學研究所病理學研究室）參考文獻1，Valente A

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