1、    PAI-1在TGF-1基因和反義TGF-1基因轉染人肝癌細胞株中的表達        摘要目的：通過對人肝癌細胞株(SMMC-7721)轉染TGF-1基因及反義TGF-1基因，觀察該細胞PAI-1表達的變化。方法：采用電穿孔法進行基因轉染，并用Western blot、Northern blot法加以鑒定后，分別應用Western blot及Northern blot觀察該細胞表達PAI-1 mRNA的變化。結果：過表達的TGF-1細胞克隆PAI-1 mRNA表達均高

2、于對照組，而低表達TGF-1者PAI-1 mRNA表達低于對照組。結論：TGF-1可能通過上調肝癌細胞PAI-1的表達，在肝癌浸潤和轉移過程中發揮重要作用。關鍵詞肝腫瘤；肝癌細胞株；轉化生長因子-；纖溶酶原激活物抑制劑；轉染中分類號R735.7文獻標識碼A文章編號1001-7399(2000)03-0221-03Expression of PAI-1 on human hepatoma cells transfected by TGF-1 gene and antisense-TGF-1 vectorLin WenshengZhang NongZhang SongwenGu Jianxin G

3、uo Muoyi（Shanghai Medical University, Shanghai200032）ABSTRACTPurposeTo study the expression of PAI-1 on human hepatoma cells (SMMC7721) transfected by TGF-1 gene and antisense-TGF-1 vector. MethodsElectroporation for gene transfection, which was confirmed by Western blot and Northern blot; Northern

4、blot and Western blot analysis were used for detecting the expression of PAI-1 on transfectants. ResultsHigher and lower mRNA levels of PAI-1 were observed in SMMC 7721 cells transfected with TGF-1 gene and antisense-TGF-1 vector, respectively. ConclusionIt is possible that TGF-1 is involved in the

5、invasion and metastasis of human hepatoma by upregulating PAI-1 expression.KEY WORDSliver neoplasms;hepatoma cell line; transforming growth factor beta; plasminogen activator inhibitor;transfection纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)在肝細胞性肝癌中過表達與肝癌的侵襲行為密切相關13。同時，大量研究結果表明，轉化生長因子-1(TGF-1)具有多種生物學活性，與腫瘤生物學行為密切相關，在肝細胞性肝癌中

6、表達增強4。為了研究肝細胞性肝癌中過表達TGF-1和PAI-1間是否有內在聯系，本實驗將TGF-1基因和反義TGF-1轉染SMMC 7721人肝癌細胞株，觀察TGF-1對該細胞表達PAI-1的影響，以明確TGF-1在肝癌發生浸潤和轉移過程中的作用。1材料與方法1.1重組真核表達質粒pcDNA3-TGF-1和pcDNA3-ASTGF-1的構建質粒轉化擴增、提取、酶切和片段回收按文獻方法進行5。將真核表達質粒pcDNA3(Invitrogen公司)和pSp65 TGF-1用EcoRI酶解，分別回收線性pcDNA3載體和TGF-1片段，pcDNA3載體用堿性磷酸酶處理后與TGF-1 cDNA片段連接

7、形成重組質粒，篩選轉錄方向正確和相反的重組體分別命名為pcDNA3-TGF-1和pcDNA3-ASTGF-1。1.2SMMC 7721細胞的轉染和篩選取75%融合的SMMC 7721細胞用胰酶消化，預冷的PBS吹打后轉移入離心管中，離心，再加入預冷的PBS洗滌1次，離心，再加預冷PBS 0.8 ml，轉移入Cuvettes管(Bio-Rad公司)中，加20 l pcDNA3-TGF-或pcDNA3-ASTGF-1質粒，冰浴5 min，電擊(200V，1 000 F)，冰浴10 min，轉移入培養瓶，加20倍體積的10%血清，RPMI1640培養液(Gibco-BRL公司)。48 h后，改用含4

8、00 mg/L G418，10%小牛血清，RPMI1640培養液。14天后克隆形成，挑10個單克隆至24孔板，10天后再由24孔板轉移至培養瓶，在37 CO2培養箱中培養。1.3Western blot鑒定轉染SMMC7721細胞TGF-1表達亞融合狀態的細胞，棄上清，PBS洗2次，加2 ml無血清培養液，48 h后收集上清，離心，上清中加入等量三氯乙酸沉淀，再用0.5 mol/L NaOH溶解沉淀，進行12% SDS-PAGE變性電泳，PVDF膜轉移，一抗為兔抗人TGF-1多克隆抗體(1500，Sant Cruz公司)，二抗為生物素化鼠抗兔IgG(1500，華美公司)。1.4TGF-1基因轉

9、染的SMMC 7721細胞的鑒定上述經鑒定表達轉染TGF-1基因(SMMC-TGF)和反義TGF-1(SMMC-ASTGF)的SMMC 7721細胞生長至融合時，用Trizol試劑(Gibco-BRL公司)提取細胞總RNA，取40 g進行1%變性瓊脂糖凝膠電泳和膜轉移，紫外線Cross-Linkage固定，-32P-dATP(Amersham公司)隨機引物法標記TGF-1，PAI-1 cDNA探針(由本校分子遺傳教研室朱運松教授提供)。按常規方法進行Northern blot雜交。2結果2.1重組質粒鑒定載體pcDNA3經EcoRI酶切后顯示5.4 kb片段，重組質粒pcDNA3-TGF-1經

10、EcoRI酶切后顯示5.4 kb和1.6 kb兩個條帶；經KpnI酶切后顯示0.6 kb和6.4 kb兩個條帶，而pcDNA3-ASTGF-1經EcoRI酶切后顯示5.4 kb、1.6 kb兩個條帶，經KpnI酶切后顯示1.0 kb和6.0 kb兩個條帶。證明TGF-1及反義TGF-1基因已被正確地重組到pcDNA3載體中(1)。1重組質粒pcDNA3-TGF-1鑒定：pcDNA3-TGF-1質粒EcoRI酶切。pcDNA3-TGF-1質粒Kpnl酶切。DNA Marker:DNA(EcoR1+Hind)。pcDNA3-ASTGF-1經EcoRI酶切。pcDNA3-ASTGF-1經Kpn I酶

11、切。2.2TGF-1基因和反義TGF-1轉染SMMC 7721細胞鑒定Western blot結果顯示：與對照組(SMMC 7721)相比，轉染反義TGF-1基因(SMMC-ASTGF)細胞分泌TGF-1蛋白被極大地抑制，而轉染TGF-1基因(SMMC-TGF2、3、4)細胞分泌TGF-1蛋白則比對照組高2倍(2)。Northern blot結果表明：SMMC-TGF2、3、4和SMMC-ASTGF分別表達較多的2.5 kb TGF-1 mRNA和反義TGF-1 RNA(3)。2.3TGF-1對SMMC 7721細胞的PAI-1表達的影響Northern blot結果顯示：與對照組相比，SMM

12、C-TGF2、3、4細胞表達3.2 kb PAI-1 mRNA明顯提高，而SMMC-ASTGF細胞表達3.2 kb PAI-1 mRNA明顯減少(3)。2Western blot檢測TGF-1多肽：SMMC 7721細胞。SMMC-TGF1細胞。SMMC-ASTGF細胞。SMMC-TGF2細胞。SMMC-TGF3細胞。SMMC-TGF4細胞。3Northern blot檢測TGF-1和PAI-1 mRNA表達：SMMC 7721。SMMC 7721細胞轉染pcDNA3。SMMC-TGF2細胞。SMMC-TGF3細胞。SMMC-TGF4細胞。SMMC-ASTGF細胞。PAI-1為3.2 kb P

13、AI-1 mRNA, TGF為2.5 kb TGF-1 RNA, GAPDH為內參照。3討論研究表明，組織型和尿激酶型纖溶酶原激活物(tPA，uPA)介導的纖維蛋白溶解與腫瘤的浸潤和轉移密切相關，PAI-1作為tPA和uPA的生理抑制劑，通過與tPA和uPA相互作用，參與腫瘤的侵襲性生物學行為7。以往研究發現，惡性腫瘤中PAI-1過表達可能與腫瘤增生時的血管生成有關，也有作者認為PAI-1的升高是腫瘤擴散的標志3，8，9。最近，鄭起等在人肝細胞性肝癌和人肝細胞性肝癌裸鼠轉移模型中均發現，PAI-1表達明顯提高，并證實肝癌過表達PAI-1與其侵襲性和術后復發相關。文獻報道5，在人的正常肝臟中TG

14、F-1 mRNA和蛋白一般無明顯表達，只有在肝發生纖維化或硬化時，部分Ito細胞和間質細胞可表達TGF-1 mRNA，而肝細胞則始終不表達TGF-1 mRNA和蛋白。然而大量研究證明，肝細胞性肝癌細胞可有明確的TGF-1 mRNA和蛋白表達。Shirai等10也曾報道肝癌病人血漿中TGF-1含量上升，并比肝炎和肝硬化患者更為明顯增強。同時Tsai等11也觀察到肝癌病人的尿中TGF-1濃度上升，且上升程度與肝癌大小及分布狀態相關。大量實驗研究表明，體外培養的肝癌細胞也表達TGF-1 mRNA和蛋白，并發現TGF-1能誘導一部分人肝癌細胞株(如HepG2,Hep3B,HuH-7細胞等)生長抑制或凋

15、亡；而另一部分人肝癌細胞株(如Hep3B-TR細胞)對TGF-1卻無反應12。但TGF-1對肝癌細胞生物學行為的影響及作用機制至今未被闡明。本實驗采用轉基因技術，建立過表達TGF-1和低表達TGF-1的細胞株，在國內首次觀察他們對PAI-1 mRNA表達的影響，從而為進一步闡明TGF-1在肝癌發生發展中的作用提供了一個重要實驗依據。基金項目：國家“九五”攻關項目(96-906-01-15)、上海市教委重點學科基金及CMB基金(93-583)資助項目作者簡介：林文生，男，27歲，博士研究生。研究方向：腎小球硬化機制，腫瘤浸潤和轉移的機制郭慕依，男，59歲，教授，博士生導師，中華醫學會上海分會病理

16、學會委員。研究方向：腎小球疾病診斷及腎小球硬化機制作者單位：林文生（上海醫科大學病理學教研室）張農（上海醫科大學病理學教研室）張頌文（基因研究中心200032）顧建新（基因研究中心200032）郭慕依（上海醫科大學病理學教研室）參考文獻1，鄭起，湯釗猷，吳志全等.纖溶酶原激活物抑制物1與肝細胞癌.中華外科雜志，1998；36：4744762，鄭起，湯釗猷，吳志全等.尿激酶型纖溶酶原激活物及其特異受體和抑制物與肝細胞癌浸潤轉移及預后.中華腫瘤雜志，1998；20：57593，鄭起，湯釗猷，薛瓊.人肝癌裸鼠轉移模型中纖溶酶原激活物抑制物抑制劑變化與肝癌生物學特性.中華外科雜志，1998；36：68

17、76894，鄒偉，楊梅懷，古寶亮等.轉化生長因子1，表皮生長因子受體表達與非小細胞肺癌淋巴結轉移及預后的關系.臨床與實驗病理學雜志，1999；15(1)：24265，Bedossa P, Peltier E, Terris B et al. Transforming growth factor-beta 1(TGF-1) and TGF-1 receptor in normal, cirrhotic, and neoplastic human livers. Hepatology,1995;21(3):7607666，薩姆布魯克(金冬雁，黎孟楓等譯).分子克隆實驗指南.第2版，北京：科學出版社

18、，1995：345388，4565357，彭挺生，趙國華，周慕珩.纖溶酶原激活系統在肺癌中的表達和意義.臨床與實驗病理學雜志，1998；14(4)：3913938，Grondahl-Hansen J, Chriestensen IJ, Rosenquist C et al. High levels of urokinase-type plasminogen activitor and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res,1993;53:251325219，Kuhn W, Pache L, Schmalfeldt B et al. Urokinase (uPA) and PAI-1 predict survival in advanced ovarian cancer patients (FIGO ) after radical surgery and platinum-based chemotherapy. Gynecol O