1、相關妊娠疾病胎盤組織中金屬蛋白酶組織抑制因子和纖溶酶原    摘要目的：探討金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）和纖溶酶原激活物抑制因子（PAI）表達差異與葡萄胎、先兆子癇等滋養層細胞相關妊娠疾病病理機制的關系。方法：采用逆轉錄多聚酶鏈反應檢測方法，比較葡萄胎組織、早孕絨毛、先兆子癇足月胎盤和正常（自然分娩和剖宮產）足月胎盤組織中TIMP-1、TIMP-3和PAI-1等的表達差異。結果：早孕絨毛中TIMP-1和PAI-1的表達明顯強于其在葡萄胎組織中的表達，而葡萄胎組織中TIMP-3的表達明顯強于早孕絨毛組織。正常足月胎盤絨毛組織中TIMP-3的表達也強于

2、早孕絨毛。與正常足月胎盤絨毛組織相比，TIMP-3在先兆子癇足月胎盤組織中的表達更強。此外，自然分娩足月胎盤絨毛組織與剖宮產足月胎盤絨毛組織相比，TIMP-1、TIMP-3和PAI-1的表達差異均無顯著性。結論：TIMP和PAI-1在胎盤絨毛組織中的表達變化，可能與葡萄胎、先兆子癇等與滋養層密切相關的妊娠疾病的病理發生有關。 關鍵詞：胎盤疾??；先兆子癇；葡萄胎；金屬蛋白酶組織抑制因子；纖溶酶原激活物抑制因子 滋養層細胞的生物行為異常與多種妊娠疾病的發生有關，包括先兆子癇或子癇、反復流產、胎兒宮內發育遲緩和葡萄胎、絨毛膜癌等。在正常情況下，滋養層細胞對子宮內膜進行有節制的侵入。而該侵入行為與基質

3、金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）的活性密切相關，滋養層細胞通過表達和分泌這些蛋白酶而獲得對細胞外基質的降解能力1。金屬蛋白酶組織抑制因子（tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP）可與MMP結合形成復合物，抑制MMP的活性2。而纖溶酶原激活物抑制因子（plasminogenactivatorinhibitor，PAI）也可通過抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的活性，阻止MMP蛋白的加工成熟，并最終降低MMP活性3。為探討TIMP和PAI與先兆子癇、葡萄胎等妊娠疾病病理發生機制的關系，我們觀察其在正常早孕、足月胎盤絨毛

4、以及葡萄胎、先兆子癇的胎盤絨毛組織中表達的差異。 1材料與方法 11材料所有取材對象的年齡限制在2325周歲。早孕絨毛取自健康無妊娠疾病史的人工流產患者（23歲，孕8周）；葡萄胎水泡樣胎塊組織取自經病理學檢查確診的良性葡萄胎患者（23歲，停經73d）；胎盤組織取自胎盤母體面，厚約1cm，選取胎盤小葉并剔除基底纖維層，其中正常胎盤組織取自健康無特殊病史的足月自然分娩或剖宮產患者，先兆子癇胎盤組織取自孕前無高血壓等病史的先兆子癇患者（足月自然分娩）。將新鮮取得的胎盤絨毛組織用生理鹽水洗滌干凈后迅速移至液氮中凍存，并于1個月內使用。 12試劑型總RNA提取試劑盒購自華美生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯

5、（diethylpyrocarbonate）、礦物油、溴化乙錠（EB）為Sigma公司產品；dNTPs、RNase抑制劑、TaqDNA聚合酶等購自大連寶生物公司；MMLV逆轉錄酶、無RNase的DNase、oligo（dT）15購自美國Promega公司；瓊脂糖由上海伯奧科技有限公司生產；其他試劑均為分析純。所用引物均根據Genbank人類基因序列應用DNAMAN40引物設計軟件輔助設計，由Sangon公司合成，各基因擴增引物的詳細信息如表1。 13總RNA提取按華美公司的試劑盒操作說明書操作，所用一切器械均預先用DEPC浸泡后高壓滅菌處理。稱取約100mg組織，置于組織研磨器內，加入1mL冰

6、預冷的biotragents（酚和異硫氰酸胍的混合物），用力研磨直至組織全部被研磨成漿狀。將組織勻漿液轉移至15mL離心管中，10000×g離心5min，留取上清液。加入02mL氯仿，劇烈振蕩混合10s，4、10000×g離心20min。移取上層水相，與等體積異丙醇混勻，4靜置30min。4、10000×g離心20min，棄上清液。用75乙醇洗滌RNA沉淀及管壁后晾干，用無RNase污染的水溶解。向提取的RNA樣品加入5U無RNase的DNase，室溫下放置2h以降解除去其中的基因組DNA。酚氯仿再次純化后，測定260280nm吸光度值以估計RNA樣品的濃度及純度

7、。 14逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）按文獻4的方法。用MMLV逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，將以下溶液混合：4L5×MMLV緩沖液、4L各為25mmolL的dNTP混合液、1L100gmLoligodT、RNA酶抑制劑20U、12g煮沸變性的RNA樣品，100200UMMLV逆轉錄酶，加三蒸水至總體積20L，37反應60min，然后于95加熱5min以滅活逆轉錄酶。取一新的05mL離心管，依次加入“上游”及“下游”引物（20molL）各025L，4種dNTP的混合液（每種濃度為25mmolL）25L，10×PCR擴增緩沖液2L，逆轉錄產物1L，加水至20L。97變性5m

8、in，冷卻至4。加TaqDNA聚合酶12U。加20L輕礦物油覆蓋于反應混合液上。根據引物退火溫度設定PCR反應參數（941min、505515min、7215min），35次循環。最后502min，7210min。將產物于1瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察。 15數據處理電泳圖像經掃描后用Bandleader（30）軟件進行灰度分析，計算待檢基因條帶與內標基因（GAPDH）條帶的光密度比值。 2結果 21不同絨毛組織中TIMP-1的表達在由5種胎盤絨毛組織提取的RNA樣品中，采用RT-PCR方法僅觀察到早孕絨毛和葡萄胎組織中TIMP-1的表達較為明顯，而正?；蛳日鬃影B足月胎盤組織均未見其顯著表達

9、。在相對表達量上，早孕絨毛中TIMP-1的表達明顯強于其在葡萄胎組織中的表達。見圖1。 22TIMP-3在不同絨毛組織中的表達在5種不同的胎盤絨毛組織中均可檢測到TIMP-3mRNA的表達，其中葡萄胎組織中TIMP-3的表達明顯強于早孕絨毛組織，正常足月胎盤絨毛組織中TIMP-3的表達也強于早孕絨毛。與正常足月胎盤絨毛組織相比，TIMP-3在先兆子癇足月胎盤組織中的表達更強。此外，自然分娩足月胎盤絨毛組織與剖宮產足月胎盤絨毛組織相比，TIMP-3的表達差異無顯著性。見圖2。 23PAI-1在不同絨毛組織中的表達5種絨毛組織均表達PAI-1，且早孕絨毛中PAI-1的表達最強，大于其在葡萄胎等其他

10、組織中的表達量。然而，先兆子癇足月胎盤組織與正常足月胎盤組織中PAI-1的表達差異無顯著性。見圖3。 3討論 在胎盤形成發育過程中，滋養層細胞對母體蛻膜及螺旋動脈的有節制侵入對于正常妊娠的成功建立起著關鍵作用，滋養層細胞的侵入缺陷與先兆子癇等多種妊娠疾病的病理發生發展有關5。滋養層細胞通過分泌MMP等蛋白水解酶類而獲得侵襲能力。MMP是一族鋅依賴性的內肽酶，迄今已發現20余種亞型，其降解底物幾乎包括細胞外基質的所有成分6。TIMP能與MMP形成11的不可逆結合復合物，抑制MMP的活性。 TIMP-1是一個分子量為28000的糖蛋白，可以抑制除MMP-2外大多數MMP的活性。然而，TIMP對腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移的調節具有雙向性。Hayakawa等7發現TIMP-1在血清中有明顯的生長因子活性，能刺激多種細胞生長，其中包括腫瘤細胞。早孕絨毛中的滋養層細胞在增殖、侵襲等行為上與腫瘤細胞有相似之處，故滋養層細胞的生長等行為也可能受TIMP-1類似的調節。我們的結果顯示，早孕絨毛和葡萄胎組織中均可檢測到TIMP-1的表達，而其在早孕絨毛組織中的表達顯著強于葡萄胎組織，提示TIMP-1表達降低可能與葡萄胎的形成過程有關。 TIMP-3是近年來在人乳腺癌中發現的一種TIMP，同樣具有抑制絕大多數MMP活性的作用。我們的研究發現，包括早孕絨毛、葡萄胎組