1、實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA表達水平         10-11-01 10:53:00     作者：熊亞莉，張勇揚，孫靜    編輯：studa20【摘要】  目的 探討實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA表達的方法。方法 以BB270femA基因表達為標準，建立實時熒光定量PCR方法，對實驗菌株femA表達進行相對定量。結果 建立的實時熒光定量PCR方法所得結果標準曲線線性關系好，熔解峰單一。隨M

2、IC變化，金黃色葡萄球菌femA表達水平也隨之變化。結論 用實時熒光定量PCR方法研究金黃色葡萄球菌femA表達量結果可靠、敏感、重復性好。 【關鍵詞】  金黃色葡萄球菌；femA基因；實時熒光定量PCR    Abstract： Objective  To establish the approach of real-time fluorescent quantitative PCR to detect femA gene in Staphylococcus aureus strains. Methods  Real-time fl

3、uorescent quantitative PCR was performed to quantify the expression of femA gene of 15 clinical stains, as compared with BB270. Results  The standard curve by real-time fluorescent quantitative PCR showed good linearity between the amount of femA RNA and cycle threshold and the melting curve ha

4、d a single peak. The variation of expression level of femA was in accordance with MIC of strains. Conclusions  The real-time fluorescent quantitative PCR in the detection of femA expression is accurate, sensitive and repeatable.    Key words: Staphylococcus aureus; femA gene; rea

5、l-time fluorescent quantitative PCR    實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time Q-PCR）由于其具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快等優點，目前已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域中，其中最主要的應用集中在以下幾個方面：DNA或RNA的絕對/相對定量分析，基因表達差異分析，基因分型。    耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant  S

6、taphylococcus aureus，MRSA）是全球感染性疾病領域研究熱點之一。已知femA是MRSA耐藥表達的重要輔助基因，與MRSA高水平耐藥成正相關1-3，但還未見研究報道兩者確切關系。本實驗利用近年來興起的實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA基因表達水平，進一步明確femA在MRSA耐藥表達中的意義。同時建立實時熒光定量PCR用于金黃色葡萄球菌RNA定量檢測的具體方法和穩定體系。    1  材料和方法    1.1  菌株和生長條件  我院微生物室從臨床送檢標本中分離鑒定所得金黃色

7、葡萄球菌，選取MSSA 4株，低耐MRSA 4株，高耐MRSA 7株。1株瑞士捐贈株：BB2701。    上述金黃色葡萄球菌在M-H培養基復蘇16 h，挑取菌落置于M-H肉湯中在37震蕩培養，測量D600nm，10倍稀釋10個濃度，取50 l菌液過夜孵育，選取菌落數在100300之間的稀釋倍數計算活菌數。    1.2  最低抑菌濃度（MIC）測定  以瓊脂平皿對倍稀釋法測定苯唑西林對16株菌的MIC值，以ATCC 25923為質控株，結果判定參照CLSI2006常規標準。    1

8、.3  RNA提取、純化、逆轉錄  采用RNA提取純化試劑盒（上海華舜生物工程有限公司），操作按說明書進行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16 U/ml，上海生工生物工程有限公司）。測D260nm以及D260/D280，取D260/D280比值>1.8者繼續下一步試驗。采用RT-PCR試劑盒（TaKaRa生物工程大連有限公司），操作按照說明書進行。反轉錄反應：42，15 min，95，2 min。    1.4  real time Q-PCR引物及方案  內參參考文獻4-10選用組成型表達基因gyrB，目的、內參基因

9、引物用OLIGO 3.0設計，用BLAST檢驗引物的特異性，由TaKaRa生物工程（大連）有限公司合成，具體見表1。采用real-time Q-PCR試劑盒SYBR PrimeScript PCR kit for perfect real time，TaKaRa生物工程（大連）有限公司，按說明書進行操作。步驟1預變性95 10 s；步驟2兩步法擴增95 5 s，60 20 s，40個循環；步驟3熔解曲線95 0 s，65 15 s，95 0 s。每個反應管均設置復管，重復試驗2次。表1  熒光定量PCR引物    1.5  PCR產物電泳分析&

10、#160; 配制1.5%瓊脂糖凝膠，40 V電泳120 min，觀察結果，凝膠成像系統成像。    1.6  數據分析  對于每一個樣品，其濃度和熒光信號增長高于背景或達到閾值時對應的循環數（Ct值）一一對應。通過標準曲線，Lightcycler配套軟件可計算出待測樣品的初始模板量。通過這些數值，我們可以計算出每個樣品femA基因相對拷貝數。    2  結  果    2.1  實時熒光定量PCR檢測方法的評估  以BB270提取的RNA逆轉錄成的cDNA10倍稀釋分別制作目的基因和內參基因擴增標準曲線，見圖1，2。同時得出目的基因擴增方程Y1=-3.167X1