1、山東花生腐霉根腐病病原鑒定摘要：利用組織分離技術和選擇性培養基純化技術對山東地區花生腐霉根腐病的病原菌進行了分離和純化。按照柯赫法則，根據余永年真菌形態學鑒定方法及利用ITS序列比對等分子生物學方法對病原菌進行了鑒定。結果表明，引起山東地區花生腐霉根腐病的病原菌為群結腐霉（Pythium myriotylum Drechsler）、旋柄腐霉（Pythium helicoides Drechsler）、畸雌腐霉（Pythium irregulare Buisman）以及終極腐霉（Pythium ultimum Trow）。關鍵詞：花生；腐霉；根腐病；鑒定Identification of Pea

2、nut Pythium Root Rot Pathogen in Shandong Abstract：Pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was isolated and purified by techniques of tissue isolation and selective media. Based on Kochs rule,the pathogen was identified.by the methods of Fungal morphological and ITS sequence alignme

3、nt. And it indicated that the pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was Pythium myriotylum Drechsler、Pythium helicoides Drechsler、Pythium irregulare Buisman and Pythium ultimum Trow.Key words: peanut; Pythium; root rot; identification近年來,隨著種植花生經濟效益的不斷提高,山東省的花生種植面積也在不斷增長，目前主要劃分的兩大優

4、勢區域，一是以種植春花生為主的膠東半島、魯中和魯東南地區的29個縣；二是以種植夏花生為主的魯西和魯西南地區黃河故道的5個縣。其中花生腐霉根腐病是影響山東花生產量的主要因素之一，由于種植面積大，產區集中，連作面積廣，給花生生產造成了很大危害。花生根部病害調查分離時，我們從以上大部分地區的花生病株中分離到了腐霉菌（Pythium sp），為了明確山東省花生腐霉根腐病的病原特征及生物學特性，為防治提供依據，作者于2007-2009年度對山東花生腐霉根腐病病原進行了研究,結果報道如下。1 材料與方法1.1 癥狀表現調查方法對山東地區不同花生產區的花生進行田間病害調查并采集發病樣本，記錄花生從播種到收獲

5、是否能受到腐霉的侵染而發病，被害植株是否萎蔫，須根的腐爛情況以及初生根、次生根和主根的尖端是否特別容易受害，根系是否完全被破壞1。1.2 病原菌分離與純化方法將從田間采集的病株須根系用自來水沖洗干凈,用吸水紙吸干表面的水珠,將病株須根系剪成長5mm 的小塊,將其放置于VP3 選擇性培養基中2 25培養。24h后不斷觀察，發現有腐霉長出立即轉移到CMA培養基上放在25恒溫箱中培養，純化，轉入CMA斜面培養，5d后菌絲長滿，放入4冰箱保存備用。1.3 病原菌致病性測定方法按照柯赫法則3，采用盆栽接種測定方法測定病原菌的致病性，將土壤滅菌后裝花盆，種花生(花育22)，花生團棵后，把4保存的菌種在CM

6、A培養基上25擴繁，長滿菌絲后按4%（菌：土）的接種量，與花盆內的土壤混勻，保濕筒保濕48h后調查發病情況，調查持續一周，從病組織分離回接菌種，并作單菌絲培養。1.4 病原菌種類鑒定方法 病原菌最適溫度及pH值測定將PDA培養基制成平板。將事先培養好的直徑5mm的病菌圓餅轉接在平板中央，分別置于4、10、15、20、25、30和35進行病原菌最適生長溫度測定。在將PDA培養基的pH值調至3-12，按照上述方法將接好菌餅的培養皿置于25恒溫培養箱內培養，定期觀察，記錄菌落生長速率以及菌落形態特征。 病原菌形態觀察將腐霉菌在CMA平板培養基上培養，3d后移取邊緣菌絲至皮氏（Petri）培養液中，2

7、5培養13d挑取孢子囊，觀察孢子囊形態，有無層出現象，游動孢子的游出方式，并且測量孢子囊大小。待出現藏卵器、雄器、卵孢子后，觀察藏卵器、雄器的形態，著生位置，配合情況及卵孢子的形態特征，每項指標分別觀察測量100個，并且測量其大小，計算平均值4。鑒定則依據孢子囊、藏卵器、雄器、卵孢子的形態特征，大小及其特性來鑒定，主要參考中國真菌志（第六卷，科學出版社，余永年主編）進行鑒定5。 病原菌ITS序列測定將事先用CMA平板培養好的病原菌的菌落刮取下來，利用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、 ITS4)進行PCR擴增，最后利用Biospin膠回收試劑盒

8、進行回收并測序6。鑒定則參照NCBI(美國國立生物技術信息中心)中的ITS序列，利用DNAstar等相關軟件進行相似序列比對。2 結果與分析 癥狀表現田間調查我們發現，魯東南地區的莒縣、莒南縣花生根腐病害較為嚴重；而魯中地區的寧陽縣花生莖腐病和根腐病造成了花生的大面積減產；膠東半島的招遠則以根腐病、白絹病為主；魯西和魯西南地區的茌平、鄄城和濟陽苗期主要以莖腐病為主，中后期則以根腐病為主。 分離、純化出病原菌從莒縣、寧陽縣、濟陽縣、茌平以及招遠等地共采集花生病株145株，利用VP3 選擇性培養基分離病組織672塊，腐霉菌、鐮刀菌、色二孢、雜菌出現的頻率分別為%、%、%和%，在上述地方采集病根和病

9、土，用黃瓜誘捕的方法分離351塊，腐霉菌、鐮刀菌、色二孢、雜菌出現的頻率分別為65.5%、8.8%、24.5%和1.2%。表1 VP3培養基分離病原菌比例Table 1 The proportion of separated pathogenic fungi of VP3地點Site塊數Number腐霉菌Pythium鐮刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它雜菌Other fungi莒縣1765573408寧陽226126955濟陽131252581茌平79243124招遠6026925合計67225623314637表1 黃瓜誘捕法分離病原菌比例Table 2 The proport

10、ion of separated pathogenic fungi of Cucumber Trapping地點Site塊數Number腐霉菌Pythium鐮刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它雜菌Other fungi莒縣103731020寧陽776611濟陽10151941茌平17170招遠53231254合計35123031864從上表1和表2可以看出腐霉菌的出現頻率最高，利用水瓊脂培養基對疑似腐霉菌進行了純化培養，得到純化培養物。經過病原菌形態觀察以及ITS序列測定，初步確定這些病原菌為腐霉（Pythium sp）。 病原菌的致病性測定隨機調查接菌四種不同腐霉的盆栽花生各8株

11、，結果表明，在盆栽接菌群結腐霉、旋柄腐霉、畸雌腐霉以及終極腐霉3天后，大部分花生表現出典型的田間發病癥狀，對照植株則生長正常。發病率依次是畸雌腐霉>群結腐霉>旋柄腐霉>終極腐霉（見表3）。通過對病變組織內病原菌的重新分離以及顯微觀察測量鑒定，新分離病菌與原接種病菌相同，表明這些腐霉菌株為花生的致病菌。表3 花生致病性測定Table 3 Determination of pathogenicity of peanut plants菌株采集地Strain collection sites接菌種類Species of inoculation發病率Morbidity病情指數Disea

12、se index寧陽P. ultimum81.82濟陽P. myriotylum88.89招遠P. helicoides83.33莒縣P. irregulare100.00 病原菌的種類 鑒定結果表明：這些菌株為腐霉菌屬的群結腐霉（Pythium myriotylum Drechsler）、旋柄腐霉（Pythium helicoides Drechsler）、畸雌腐霉（Pythium irregulare Buisman）以及終極腐霉（Pythium ultimum Trow）。試驗結果表明：4種腐霉病原菌最適生長溫度介于25-30之間，低于5和高于36菌絲生長緩慢；4種腐霉病原菌最適pH值介

13、于6-7之間。 不同采集地腐霉形態學鑒定如圖圖4 群結腐霉的形態Fig. 4 Morphology of Pythium myriotylum1-2 孢子囊3 泡囊4-5 泡囊破裂產生游動孢子6 休止孢子7 休止孢子萌發產生芽管8-9 藏卵器、雄器和卵孢子標尺=10mPythium myriotylum Drechsler菌落形態：菌落在CMA上無特定形態，菌絲發達，分枝，粗9.0m 。孢子囊由膨大與不膨大菌絲構成，膨大部分指狀或裂瓣狀，頂生或間生；游動孢子腎形，雙鞭毛。藏卵器球形或近球形，直徑24（平均）m，平滑。頂生或間生。雄器棒狀或鉤狀，著生于分枝的雄器柄頂端，與藏卵器接觸，每個藏卵器有

14、多個雄器，卵孢子球形，直徑2129（平均）m，平滑，不滿器，偶有滿器，壁厚（平均）m，內含貯物球和折光體各一個。（圖4）圖5 旋柄腐霉的形態Fig. 5 Morphology of Pythium helicoides1-2 孢子囊3 孢囊層出4-6藏卵器、雄器和卵孢子標尺=10mPythium helicoides Drechsler菌落形態： 菌落在CMA上呈放射狀，氣生菌絲棉絮狀。菌絲發達，粗，分枝繁茂。孢子囊梨形、倒卵形，較少近球形，具有一乳突，頂生或間生，近球形孢子囊直徑為（平均）µm，梨形孢子囊為38.2µm×19；孢子囊有孢囊層出現象，常常在孢子囊內

15、部層出23層。藏卵器球形，直徑（平均）µm，平滑，多數為頂生，少數切生。雄器較大，整個附著在藏卵器上，多橘瓣狀，少數棍棒狀，少數邊緣不規則，卵孢子球形，直徑2232（平均）m，平滑，不滿器。（圖5）圖6 畸雌腐霉的形態Fig.6 Morphology of Pythium irregulare1-2 孢子囊3-7 藏卵器和雄器8-9 卵孢子標尺=10mPythium irregulare Buisman菌落形態：菌落在CMA上呈放射狀，菌絲發達，不規則分枝，粗，孢子囊梨形、檸檬形，或近球形，頂生或間生，1225（平均）µm，藏卵器球形，多間生，偶有頂生，1525（平均20）

16、µm，藏卵器壁上常有多個突起。雄器多與藏卵器同絲生，常無柄，卵孢子球形，平滑，單生偶有雙生，不滿器，1122（平均）µm，內含貯物球和折光體各一個。（圖6）圖7 終極腐霉的形態Fig. 7 Morphology of Pythium ultimum1-3 菌絲膨大體4-5 藏卵器和雄器6 卵孢子標尺=10mPythium ultimum Trow 菌落形態：菌落在CMA上呈放射狀，菌絲發達，分枝繁茂，粗，菌絲膨大體近球形，多間生，1432（平均）µm，藏卵器球形，平滑，多頂生，少間生，直徑1330（平均20）µm，雄器多緊靠藏卵器形成，受精管明顯可見，粗

17、約，卵孢子球形，平滑，不滿器，1025（平均）µm，內含貯物球和折光體各一個。（圖7）分離腐霉測序結果及同源性比較圖8 分離不同地區腐霉菌株基于ITS序列的系統發育樹狀圖Fig.8 Phylogenetic tree based on ITS sequences of Pythium collected from different areas 在形態學鑒定的基礎上，用Blast對所分離腐霉菌株的ITS序列與GenBank中已有的ITS序列進行比對，發現大部分腐霉菌株與GenBank中登記的群結腐霉（GQ121316）、旋柄腐霉（AB108052）、畸雌腐霉（AB107995）這3個

18、腐霉種的相似性較高，都在96以上；少數分離腐霉與終極腐霉（AB355596）的相似性雖然比較低，但遺傳距離較其他種要近。本研究未分離、鑒定到其他腐霉種類，分析其原因可能是由于地理區域不同所致。3 結論與討論研究表明，腐霉是花生根部病害的主要致病菌，它能在苗期侵入，破壞植物的根部，降低植物的抗性，為其他致病菌的侵染提供侵入途徑和侵染條件，加劇其他病害的發生。其中尤以群結腐霉為重，Garrren(1966)和孟憲曾(1982)都曾對其有過相關的報道；而近年來有關終極腐霉和畸雌腐霉能引起根腐病的報道屢見不鮮，但在花生根腐病上還未有深入的研究；旋柄腐霉是在此次研究中發現的新致病腐霉，國內外至今仍未有相關的報道，其致病機理有待于進一步的研究。目前，腐霉種類的鑒定仍以形態學方法為主。分子生物學方法