1、復方首烏藤合劑微生物限度檢查的驗證論文作者：張婷 鄭紹忠 劉全芳2012-1-18 10:58:33摘要 目的：確定可行的復方首烏藤合劑微生物限度檢查法。方法：根據中國藥典2010年版二部附錄 J微生物限度檢查法常規法進行驗證試驗。結果：試驗組的菌回收率均大于70%，控制菌常規法驗證檢出陽性菌，陰性菌未檢出。結論：復方首烏藤合劑無抑菌作用，可用常規法進行微生物限度檢查。關鍵詞 復方首烏藤合劑；微生物限度檢查；驗證中圖分類號 R927.33 文獻標識碼 A 文章編號 1673-7210（2011）11（a）-076-03Validation of microbial limit test met

2、hod of Compound Caulis Polygoni Multiflori MixtureZHANG Ting, ZHENG Shaozhong, LIU QuanfangDepartment of Pharmacy, the 175th Hospital of PLA (the Southeast Hospital Affiliated to Xiamen University), Fujian Province， Zhangzhou 363000, ChinaAbstract Objective: To establish a method for the microbial l

3、imit test of Compound Caulis Polygoni Multiflori Mixture. Methods: A validation of microbial limit test method was conducted in accordance with routine method in the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2010 edition two parts ). Results: The recoveries of test organisms by routine method were more tha

4、n 70%, the test organisms were detected in the control bacteria test and were not detected in the negative control bacteria test. Conclusion: The Compound Caulis Polygoni Multiflori Mixture has no inhibitory effect, and conventional method can be used in microbial limit test.Key words Compound Cauli

5、s Polygoni Multiflori Mixture; Microbial limit test; Validation微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目，目前在國外也越來越受到重視，每版藥典收載的品種也越來越多。復方首烏藤合劑是我院自制的中成藥口服液，有滋陰清肝、清心安神作用，主要用于神經衰弱性失眠、眩暈及腦外傷性頭痛、頭昏等。中國藥典2010年版規定建立微生物限度檢查法時，應對該方法進行驗證，以確定該方法的可行性。筆者依據中國藥典2010年版二部附錄1對該品種進行了菌落計數和控制菌檢查方法的驗證2。1 儀器與試藥1.1 儀器DG-2B多功能恒溫箱（上海醫療器械廠）；HWS-40

6、0型恒溫恒濕箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；101-2A型數顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。1.2 藥品復方首烏藤合劑（解放軍第一七五醫院制劑室，40 ml/瓶，批號：100609、100623、100721）。1.3 試驗用菌株大腸埃希菌（escherichia coli）CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）CMCC（B）63501、黑曲霉（aspergillus niger）CM

7、CC（F）98003和白色念珠菌（candida albicans）CMCC（F）98001，以上菌種均購于廈門市藥品檢驗所，金黃色葡萄球菌為第三代，大腸埃希菌為第二代，其余菌均為第四代。1.4 培養基營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基，以上培養基均購于廣東環凱微生物科技有限公司。1.5 稀釋液pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，購于廣東環凱微生物科技有限公司。2 方法與結果2.1 菌落計數方法的驗證32.1.1 供試液的制備用pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將復方首烏藤合劑稀釋成為110的供試液，充分混勻備用。2.1.2

8、菌液制備2.1.2.1 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物用接種棒接種至營養肉湯培養基中，于（351）培養1824 h。2.1.2.2 取白色念珠菌的新鮮培養物用接種棒接種至改良馬丁瓊脂培養基中，于（251）培養2448 h；上述培養物均用滅菌生理鹽水制成每毫升含菌數小于100 cfu的菌懸液，做活菌計數用。2.1.2.3 取黑曲霉新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，于（251）培養57 d，使黑色的霉菌孢子大部分覆蓋培養基斜面為宜，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的滅菌生理鹽水并輕輕振搖洗脫下霉菌孢子，過濾孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（m

9、l/ml）聚山梨酯-80的滅菌生理鹽水制成每毫升含菌數小于100 cfu的菌懸液，做活菌計數用。2.1.3 菌落計數方法的驗證操作試驗組：分別吸取上述制備好的110供試液1 ml注入平皿中，再分別加入上述制備好的的5種菌的菌懸液各1 ml，每種菌平行制備2份，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基。供試品對照組：分別吸取上述制備好的110供試液1 ml注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每種培養基平行制備2份，以測定供試品的本底菌數。菌液組：取上述制備好的5種菌的菌懸液1 ml注入平皿內，每種菌平行制備2份，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，測定所加的試驗菌數

10、，并計算回收率。回收率公式為回收率（%）（試驗組菌落計數-供試品對照組菌落計數）/菌液組菌落計數100%。以上營養瓊脂培養基置3035培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置2328培養72 h，結果見表1。由表1可見，筆者對復方首烏藤合劑采用平皿法，經過3次平行試驗，5種菌的回收率均大于70。故本品的細菌、霉菌、酵母菌數的測定可依據中國藥典2010年版直接取樣采用常規法。2.2 控制菌檢驗方法的驗證42.2.1 陽性試驗組取上述110供試液10 ml加至100 ml膽鹽乳糖培養基中，再加入10100 cfu的大腸埃希菌，依相應控制菌檢查方法進行檢查。2.2.2 陰性菌對照組方法同試驗組，陰性對照菌

11、采用金黃色葡萄球菌，依相應控制菌檢查方法進行檢查。見表2。從表2可以看出，采用常規法檢驗復方首烏藤合劑的控制菌，陽性試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應，故可用該法進行復方首烏藤合劑控制菌的檢查。3 討論驗證試驗結果表明復方首烏藤合劑無抑菌作用，可依據中國藥典2010年版按常規方法進行微生物限度檢查。筆者發現，復方首烏藤合劑靜置一段時間后會生成沉淀，在試驗時，應充分搖勻，使其分散均勻，且本品雖進行了10倍稀釋，但顏色依然較深，在光線較暗的環境下進行菌落計數時不容易分辨菌落，因此應在光源充足的環境下進行菌落計數，對疑似菌須進行菌落培養，確定其是否為菌，以免發生漏數、少數現象，造成試驗結果不準

12、確。菌落數的控制在小于100 cfu/ml是試驗過程的一大難點，是一項較耗時的操作過程，通常需要多次實踐才能夠得到符合要求的菌落數。菌落的生長繁殖能力極其旺盛，呈指數級別遞增，因此，在用接種棒接種至相應培養基進行增菌，并進行稀釋這個過程的重現性很差，很難在同一個稀釋級得到相同數目的菌落數，筆者通過多次試驗，并查閱相關資料，發現可將細菌稀釋至10-6（真菌稀釋至10-5），并在其附近選取稀釋至10-510-7（真菌選取10-410-6）的菌懸液，每個稀釋級取1.0 ml與0.5 ml同步試驗，可大大提高菌落數在100 cfu/ml的范圍，減少一些繁瑣且不必要的操作。參考文獻1 國家藥典委員會.中國藥典S.二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄93.2 呂毅.麻杏止咳糖漿的微生物限度檢查J.華西藥學雜志，2009,24(1):102-103.3 楊靜,陳偉,馬寧,等.抗腦衰膠囊微生物限度檢查方法學驗證J.醫學理論與實