1、植物學通報2006, 23 (2: 129137Chinese Bulletin of Botany收稿日期:2005-07-26;接受日期:2005-12-20基金項目:教育部科學技術研究重點項目(103093*通訊作者Authorforcorrespondence.E-mail:z gshen.研究論文.銅脅迫對玉米幼苗生長、葉綠素熒光參數和抗氧化酶活性的影響胡筑兵陳亞華王桂萍沈振國*(南京農業大學生命科學學院南京210095摘要本文研究了銅(Cu脅迫下玉米(Zeamays 幼苗生長、葉綠素含量、葉綠素熒光參數和抗氧化酶活性的變化。研究結果表明,520mol .L -1Cu處理10天明顯抑

2、制玉米幼苗根系生長,并減少玉米幼苗的干物重,以及增加玉米幼苗地上部和根系含Cu量;玉米幼苗吸收的Cu大部分積累在根系,在地上部分布較少。Cu處理還降低玉米葉片的葉綠素含量和F v /F m 、ETR、q P 和q y 值。在10天的Cu處理期間,根系中S O D 、P O D 、C A T 和G R 活性呈現先上升后下降的趨勢。而葉片中的S O D、P O D、C A T 和G R 活性在處理前期不受Cu脅迫的顯著影響,處理后期則因Cu脅迫而增強。實驗表明抗氧化酶在抵御過量Cu引起的氧化脅迫中發揮了一定的作用。關鍵詞玉米,銅脅迫,葉綠素熒光,抗氧化酶Effects of Copper Stre

3、ss on Growth, Chlorophyll FluorescenceParameters and Antioxidant Enzyme Activities ofZea mays SeedlingsZhubingHu,YahuaChen,GuipingWang,ZhenguoShen *(CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity ,Nanjing210095Abstract G rowth,c hlorophyllc ontent,c hlorophyllf luorescencep arametersa nda ctivi

4、tyo fa ntioxi-dantenzymesincornseedlingswereinvestigatedunderhydroponicssuppliedwithdifferentconcen-trationsofCu.Rootgrowthofcornseedlingswassignificantlyinhibitedanddryweightwasde-creasedwith5-20m ol .L -1Cu.ChlorophyllcontentandF v /F m ,ETR ,q Pandq y inleaveswerealso significantlydecreasedundere

5、xcessCu.TheCuconcentrationsinshootsandrootsincreasedwith increasingCuconcentrationinthenutrientsolution.However,mostabsorbedCubycornseedling waslocatedinroots.AtalllevelsofCutreatment,theamountofCuwassubstantiallyhigherinroots thaninshoots.Duringthe10-dayCutreatment,theactivitiesofSOD,POD,CATandGRin

6、itially increasedandthendecreasedinroots.Butfortheleaves,short-termtreatmentwithexcessCuhadno significanteffectontheseenzymeactivities.Prolongedexposurefor4daysresultedinincreased enzymea ctivities.T hus,a ntioxidante nzymesh avef unctionst oa lleviatet het oxice ffectso fo xidative stresscausedbyex

7、cessCu.KeywordsZeamays ,copperstress,chlorophyllfluorescence,antioxidantenzymes13023(2銅(Cu是植物生長的必需微量元素,參與植物的光合作用等許多過程,在植物的正常生長發育過程中起著重要的作用,但植物組織中過量的Cu又會對植物產生毒害作用(Marschner, 1995。過量的Cu能夠降低植物葉片中葉綠素含量,破壞類囊體上的色素蛋白復合體的結構,影響植物的原初光化學反應和PS的光合電子傳輸(Ptsikk et al., 1998; Mys liwa-Kurdziel and S trzatka, 2002; M

8、 ysliwa-Kurdziel et a l., 2002; Ptsikk et al., 2002。Cu是可變價金屬離子,植物細胞中的Cu可以通過Haber-Weiss和Fenton反應促使植物細胞累積羥自由基(.O H和過氧化氫(H2O2(PolleandSchzendb el, 2003。累積的活性氧可以引發脂質和蛋白質的過氧化作用,從而嚴重干擾植物正常的生理代謝(Maksymiec,1997;LombardiandSebastiani, 2005。活性氧產生后,植物體內清除系統會啟動以減輕或消除活性氧累積對植物的傷害,主要有酶促系統和非酶促系統兩類。前者主要包括超氧化物歧化酶(sup

9、eroxidedismutase, SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT、過氧化物酶(peroxidase,POD、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX和谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase,GR,后者主要指抗壞血酸(ascorbicacid,AsA、類胡蘿卜素(carote-noid,Car以及一些含巰基的低分子化合物等(Mittler,2002;JiangandZhang,2002a。重金屬脅迫下,抗氧化系統清除活性氧能力的高低直接與植物對重金屬的耐性強弱有關(江行玉和趙可夫,2001。本文通過測定不同濃度Cu處理下玉米幼苗生長、葉

10、綠素熒光參數和抗氧化酶活性等的變化,探討過量銅對玉米(Zeamays幼苗生長和光合作用的影響以及抗氧化酶在植物抵御銅脅迫中的作用,以期為深入揭示植物耐Cu的機理提供一定的理論依據。1材料與方法1.1實驗材料與實驗設計供試材料玉米(Zeamays,品種為農大108。種子經10%NaClO表面消毒10分鐘,用自來水沖洗干凈,在20下浸種12小時,在25光照培養箱中催芽。挑選露白一致的玉米種子播于石英砂中,幼苗長出后,將其轉移到Hoagland營養液中,置于溫室中培養(溫度2030,濕度30%40%,光通量密度6080mol.m-2.s-1,每2天更換1次營養液。待苗長至兩葉一心后進行不同濃度Cu處

11、理,Cu處理濃度設為:0.32、5、10和20mol.L-1,Cu以CuCl2.2H2O的形式加入。Cu處理后的第1、4、7和10天取樣,測定CAT、POD、GR、S O D和A P X活性以及最大光化學效率(F v/ F m、光化學猝滅系數(q P、實際量子產額(q y、電子傳輸速率(ETR的值。Cu處理后的第10天取樣測定葉片葉綠素、葉片丙二醛(M D A含量、根系長度、根系M D A含量以及根系和地上部Cu含量和干物量。每個處理設3個重復。處理期間調節處理液pH為5.5。1.2測定方法1.2.1葉綠素含量的測定取0.1g葉片,用剪刀剪碎,浸泡在丙酮:乙醇(V:V=1:1溶液中24小時,浸

12、泡液為待測液。測定方法參照張憲政(1992的方法。1.2.2MDA含量測定MDA含量參照趙世杰等(1994改進的方法進行測定。1.2.3Cu含量的測定烘干的植物樣品用瑪瑙研缽磨碎,用HNO3-HClO4(V:V=87:13混合液消煮(Zhaoetal.,1994,之后用TAS-986火焰原子吸收分光光度計(AAS測定Cu含量。1.2.4葉綠素熒光參數的測定樣品測定前,用濕紗布保濕,暗適應30分鐘。在室溫下,用PAM210葉綠素熒光儀(HeinzWalz,Germany程序3標準參數(作用光通量密度600mol.m-2. s-1PAR測定。F v/F m、q y、q P和ETR的值由DE-TAC

13、H軟件直接讀出。1.2.5酶液提取、酶活性及蛋白質含量的測定取0.5g葉片,加入預冷的3.0mL50mmol.131 2006胡筑兵等:銅脅迫對玉米幼苗生長、葉綠素熒光參數和抗氧化酶活性的影響L-1磷酸緩沖液(內含1mmol.L-1乙二胺四乙酸和1%聚丙烯吡咯烷酮研磨至勻漿,4冷凍離心(10000g,30分鐘,上清液為酶提液。APX 的提取需在提取液中加1.0mmol.L-1AsA。S O D、C A T、A P X和G R活性參照J i a n g和Zhang(2002b的方法測定。SOD活性以抑制氮藍四唑(NBT光氧化還原50%的酶量為1個酶活性單位(U,活性用U.mg-1protein表

14、示。CAT活性用A240tein.min-1表示; APX活性用A290tein.min-1表示; GR活性用A340tein.min-1表示。不同波長下的吸光度變化用島津UV-2450分光光度計連續測定。POD活性參照Hammerschmidt 等(1982的方法測定,用島津UV-2450分光光度計連續測定460nm處的吸光度,POD活性用A460tein.min-1表示。蛋白質含量測定參照Bradford(1976的方法。1.3數據統計實驗中數據均采用Excel統計標準差;采用SPSS11.5軟件根據最小顯著差數法(LSD法進

15、行差異顯著性(P0.05分析。2結果與分析2.1Cu脅迫對植株生長、葉綠素含量、含C u量和MD A含量的影響與對照(0.32mol.L-1Cu相比,520mol.L-1Cu處理明顯抑制玉米幼苗根系生長,減少玉米幼苗根系和地上部干物重(P0.05(表1。Cu處理也顯著降低葉片葉綠素含量(P0.05,而10和20mol.L-1Cu處理顯著增加玉米根系和葉片中的MDA含量(P0.05 (表1。2.2Cu脅迫對葉綠素熒光參數的影響圖1顯示了不同濃度Cu處理下的玉米幼苗葉片F v/F m、ETR、q P和q y的變化趨勢。與對照相比,520mol.L-1Cu處理4天顯著降低玉米幼苗葉片的F v/F m

16、、E T R、q P和q y值。Cu處理濃度越高,F v/F m、ETR、q P和q y值的下降程度越大。而520mol.L-1Cu處理1天則對葉片中的F v/F m、ETR、q P和q y值沒有顯著影響。2.3Cu脅迫對根系抗氧化酶活性的影響不同濃度Cu處理下,玉米幼苗根系中C A T、P O D和S O D活性的變化趨勢見圖2。隨著Cu處理時間的延長,CAT、POD和SOD表1Cu處理10天對玉米幼苗根系長度、干物重、含Cu量、葉綠素含量和MDA含量的影響Table1Rootlength,dryweight,Cucontent,chlorophyllcontentandMDAcontent

17、ofseedlingsofZeamaysgrownu nder excess Cu supply for 10 daysCu concentrations (mol.L-10.3251020 Root Length (cm.plant-116.40.3a14.70.1b13.50.3c11.10.1d Root dry weight (mg.plant-124.80.4a21.31.2b21.01.1b20.50.9b Shoot dry weight (mg.plant-195.22.4a75.012.5b71.54.8b80.02.6b Root Cu content (g.g-1 DW9

18、6.95.2d591.449.3c715.978.1b1012.324.4a Shoot Cu content (g.g-1 DW16.20.3b21.92.0a20.51.6a24.22.8a Chlorophyll content (mg.g-1 FW 3.160.30a 2.690.04b 2.250.22c 2.150.08c Root MDA content (nmol.g-1 FW 1.370.19b 1.510.18b 1.940.40a 1.930.29a Leave MDA content (nmol.g-1 FW 3.150.21b 3.360.15b 3.750.15a

19、3.770.26a 注:表中數值為:平均值標準誤差,不同字母表示差異顯著(P0.05,LSDtest.Notes:Dataarepresentedintheformatofmean s tandarderror;Differentlettersmeansignificantdifferenceat P0.05accordingtoLSDtest.13223(2活性的變化趨勢基本相同。在Cu處理的前4天,520mol.L-1Cu處理植株的根系CAT、POD和SOD活性均高于對照,這3種酶活性均有隨著Cu處理濃度的增加而升高的趨勢。但過量Cu處理延長到7天,根系CAT活性明顯降低并低于對照,而SO

20、D活性降低到對照植株的水平。過量Cu處理植株根系POD活性則在處理的第10天降低到對照水平以下。短時間的過量Cu處理(1和4天,有提高玉米幼苗根系中GR活性的趨勢,但延長Cu處理時間則降低GR活性(圖2。如20mol.L-1Cu 處理10天,GR活性比對照減少了28%。與對照相比,5和10mol.L-1Cu處理對玉米幼苗根系APX活性沒有顯著影響,但20mol.L-1Cu 處理顯著提高根系中APX活性(圖2。2.4Cu脅迫對葉片抗氧化酶活性的影響與對照相比,520mol.L-1Cu處理1天對玉米幼苗葉片中C A T、P O D、S O D和GR活性沒有顯著影響(圖3。Cu處理時間延長至4天,葉

21、片POD和SOD活性提高并顯著高于對照,而CAT活性則在處理的第7天才顯著提高(圖3。GR活性從Cu處理時間的第4天開始,隨Cu 處理時間的延長而逐漸提高,并顯著高于對照(圖3。而葉片中APX活性變化與其他酶具有一定差異,在Cu處理的第1天,APX活性明顯低于對照,但隨著Cu處理時間的延長,APX活性逐漸上升, 并顯著高于對照(圖3。133 2006胡筑兵等:銅脅迫對玉米幼苗生長、葉綠素熒光參數和抗氧化酶活性的影響3討論本實驗結果顯示5mol.L-1Cu即對玉米幼苗產生毒害作用。與對照相比,Cu脅迫下的玉米幼苗根系和地上部生長受到明顯抑制,并且隨著營養液中Cu濃度的增加,生長的受抑制程度也越明

22、顯(表1。植物對重金屬的耐性可以分為排斥機制和耐性機制,在排斥機制中, 植物 （） 通過減少根系吸收和向地上部運輸來降低重金 屬含量（，）； 而在耐性機制中， 物通過 植 合成蛋白質、多肽、氨基酸和有機酸等化合 物來螯合細胞內的游離金屬離子（，； ，；，； ，）。 本實驗結果顯示玉米幼苗吸 收的以上累積在根系，隨著營養液中 濃度的增加（ ）， 葉片含量的 胡筑兵等：銅脅迫對玉米幼苗生長、 葉綠素熒光參數和抗氧化酶活性的影響 上升并不明顯（表）， 顯示玉米幼苗對過量銅的 耐性機理主要是排斥機制， 這與其他植物的耐 機制相一致（，； ，； ，； ， ）。 同時，本實驗結果表明 ；，）。 在誘導 活

23、性氧產生方面，可以直接接受中電子 形成，將氧化成，然后通過反 應生成.O和（zendb， ）。 活性氧能夠攻擊質膜和細胞器膜中的 不飽和脂肪酸，引起膜脂過氧化，膜透性增大 （ ，）。 本實驗結果也顯示過量 處理下含量明顯上升（表）。 因此，膜 脂過氧化可能是 毒害植物的重要途徑之 一。目前有許多研究結果表明 對抗氧化酶 （，和等）活性的影響可 能同時表現為促進和抑制兩個方面。 一方面， 過量明顯提高抗氧化酶在轉錄水平的表達， 誘導同工酶的表達， 及對酶蛋白結構進行加工 以 與修飾， 提高酶的總活性（， ；，）。 另一方 面， 脅迫下產生的活性氧可以破壞 、 和蛋白質的結構，因而破壞抗氧化酶的表

24、 達系統和結構， 降低酶的活性（，； ，；，； ，）。 在處理初 期（天）， 一些抗氧化酶活性的升高可能與植 物適應誘導活性氧增加有關，而延長處 理時間降低一些抗氧化酶活性則可能是細胞中 過量可能直接作用于酶蛋白或影響基因表 達的結果。至于玉米幼苗葉片在 處理初期 （天）， 因運輸到地上部的較少而對抗氧化 酶活性沒有產生顯著影響。但隨 處理的延 長和地上部積累量的增加， 也一定程度上誘 導增加抗氧化酶的活性（圖）。 結果表明抗氧 化酶的增強可能是玉米幼苗對脅迫的早期 響應之一， 根系抗氧化酶對過量的響應明顯 早于葉片抗氧化酶的響應。 此外，我們的研究 結果顯示在過量的脅迫下葉片中抗氧化酶 活性

25、與葉綠素熒光參數的變化趨勢相一致（圖 和圖）， 表明抗氧化酶在抵御過量引起的氧 化脅迫中發揮了一定的作用。 處理后，葉片中含量上升均不明顯，但葉 片中光合作用的指標和抗氧化酶活性變化顯著 （表，圖和圖），我們推測處理后根系中 高含量可能作為一種信號分子， 激活葉片中 的活性氧清除系統（，）。 同時， 過 量能明顯引起根系累積， 是一個重 要的信號分子， 也是一種主要的活性氧（， ）。根系中過量的 可能被轉移到葉片 中， 引起葉片中的氧化脅迫， 脂質過氧化程度增 加， 光合作用能力下降（ ，）。 過量能明顯降低植株葉片色素含量， 破 壞內囊體膜結構， 飾加工色素分子和降低色素 修 合成酶的活性等

26、， 從而降低植物光合作用效率 （Ptsikk et al., 1998; ysliwa-Kurdziel and Strzatka, 2002; Mysliwa-Kurdziel et al., 2002; Ptsikk et al., 200）。 葉綠素熒光技術被認為 是快速檢測植物光合機構無損傷的最靈敏的探 針。 用于度量 原初光能轉換效率， 則表示通過 的電子傳輸速率。 是 天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞 的份額，較低的 反映中開放的反應中心 比例和參與 固定的電子減少。 是 的實際光化學效率， 反映吸收的光子供給 反應中心的效率（焦德茂，）。 我們的實驗結 果顯示， 過量 明顯降

27、低 、 、 和 值（表和圖），表明玉米幼苗利用光能的 效率明顯下降，的電子傳遞嚴重受阻， 這必 然導致光合作用效率的降低。過量 降低葉 片的光合作用效率可能是抑制植物生長的 原因之一。 氧化脅迫是毒害的一種重要機制（ ，；，； chzendbel， S 1015. （） 參考文獻 江 行 玉 ， 趙 可 夫 （）植物重金屬傷害及其抗性機 理 應用與環境生物學報 ， 焦 德 茂 （）運用光合機理揭示生理育種途徑（北 京： 中國農業出版社）， 張 憲 政 （） 作物生理研究法（北京： 農業出版社）， 趙 世 杰，許 長 成，鄒 琦 ，孟 慶 偉（） 植物組織中丙 二醛測定方法的改進 植物生理學通訊

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