1、流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測手段，能夠快速、精確的對單個細(xì)胞或顆粒的物理和化學(xué)特性（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流 式 細(xì) 胞 術(shù) 的 特 點（1）流式細(xì)胞術(shù)最大的特點是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號對細(xì)胞進行定量分析或純化分選。（2）測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞大小 細(xì)胞顆粒度 DNADNA含量與細(xì)胞周期 RNARNA含量 蛋白質(zhì)含量 細(xì)胞功能 細(xì)胞表面/胞漿/

2、核的 特異性抗原 細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子 激素結(jié)合位點 細(xì)胞受體 鈣離子濃度 線粒體膜電位 一、流式細(xì)胞儀的工作原理 采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率； 利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性； 用計算機系統(tǒng)對流動的單細(xì)胞懸液中單個細(xì)胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。 1.1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1） 液流系統(tǒng)（2） 光學(xué)系統(tǒng)（3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（1 1）液 流 系 統(tǒng)n 單細(xì)胞懸液n 大多數(shù)儀器檢測范圍是在50-300 50-300 m m 大小。n將細(xì)胞懸液注射進入鞘液中這一過程, ,稱為流體動力

3、學(xué)聚焦液 流 系 統(tǒng) 示 意 圖（2 2）光 學(xué) 系 統(tǒng) 由激光光源由激光光源、分色反光鏡分色反光鏡、光束成形器光束成形器、透鏡組透鏡組、濾片和光電倍增管組濾片和光電倍增管組成。成。FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector流 式 細(xì) 胞 儀 與 顯 微 鏡 的 區(qū) 別區(qū)別區(qū)別流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對象對象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等細(xì)胞、組織等承載工具承載工具鞘液及流動室鞘液及流動室載玻片載玻片檢測信號檢測

4、信號光學(xué)信號光學(xué)信號形態(tài)及染色形態(tài)及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學(xué)放大物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計統(tǒng)計計算機計算機人工人工結(jié)果結(jié)果多參數(shù)，高通量綜合分多參數(shù)，高通量綜合分析析簡單，單參數(shù)簡單，單參數(shù)二、散 射 光 的 測 量 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時向周圍360立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。前 向 散 射 光（FSFS） 前向散射光（前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸較小角度

5、較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細(xì)胞體積大小成正比信號強弱與細(xì)胞體積大小成正比。 通常在FCM應(yīng)用中，選取FS作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細(xì)胞的干擾。前 向 散 射 光 示 意 圖FALS SensorLaser前向散射光前向散射光側(cè) 向 散 射 光（SSSS） 側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射細(xì)胞時，光以激光束照射細(xì)胞時，光以9090角散射角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞的訊號，用于檢測

6、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。側(cè) 向 散 射 光 示 意 圖FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光側(cè)向散射光 光 散 射 測 量 的 用 途 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 三、熒 光 的 測 量 熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。發(fā)射的熒

7、光波長與激發(fā)光波長不同。 每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細(xì)胞上的多個不同特選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細(xì)胞上的多個不同特征。征。熒 光 染 料 的 特 性激發(fā)波長激發(fā)波長(EXCITING)(EXCITING)發(fā)射波長發(fā)射波長(EMISSION)(EMISSION)熒 光 信 號 的 檢 測 使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析使

8、用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析 熒光信號的強弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒光信號的強弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒 光 補 償5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7四、細(xì) 胞 分 選 原 理 通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。細(xì) 胞 分 選 示 意 圖細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流動室振動流動室振動液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴含細(xì)胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機械振動機械振動不充電不充電充電充電五、數(shù) 據(jù) 的

9、顯 示 與 分 析 參數(shù)：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FL 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點圖、雙參數(shù)散點圖 、二維等高、二維等高圖圖 、假三維等高圖、假三維等高圖 、三參數(shù)散點圖、三參數(shù)散點圖 ） 設(shè)門分析技術(shù)設(shè)門分析技術(shù)（一）參 數(shù) 說 明FSFS：反映顆粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類（二）數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 顯顯 示示 方方 式式直分析方圖 單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖 三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析1.1.單 參 數(shù) 直 方 圖 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒

10、光散射光或熒光) )與顆粒計數(shù)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。強度的顆粒數(shù)量的多少。單 參 數(shù) 直 方 圖細(xì)胞相對數(shù)細(xì)胞相對數(shù)量量信道信道(channel(channel ) )2.2.雙 參 數(shù) 直 方 圖 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點

11、代表一個細(xì)胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒每個點代表一個細(xì)胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。光強度的顆粒數(shù)量的多少。雙 參 數(shù) 直 方 圖 點 圖綠色熒光強綠色熒光強度度紅色熒光強紅色熒光強度度（三）設(shè) 門 分 析 技 術(shù) 1.Gate 1.Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門線性門線性門 2. 區(qū)閾區(qū)閾（RegionRegion設(shè)置）: 如十

12、字門分析時，由四個區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+（1）淋巴細(xì)胞亞群檢測： CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的變化監(jiān)測，AIDS（2）HLA-B27:強直性脊柱炎 （3） 白血病免疫分型：白血病的分類（4） 貧血的鑒定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗體 (5) . 六、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用七、流 式 細(xì) 胞 儀 的 科 研 應(yīng) 用=細(xì)胞周期的分析細(xì)胞周期的分析=干細(xì)胞研究干細(xì)胞研究=癌癥病人的多藥耐藥性癌癥病人的多藥耐藥性=細(xì)胞動力學(xué)功能研究細(xì)胞動力學(xué)

13、功能研究=環(huán)境微生物分析環(huán)境微生物分析=流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究=流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗中的應(yīng)用DNA DNA 細(xì) 胞 周 期 分 析Scell divisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)PIPI染色檢測細(xì)胞周期 ProtocolProtocol 離心收集細(xì)胞，棄上清，用離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBSPBS洗細(xì)胞兩次。洗細(xì)胞兩次。 加入預(yù)冷的加入預(yù)冷的70%70%乙醇，于乙醇，于4 40 0C C固定過夜，或固定過夜，或-20-200 0C C長期固定。長期固定。 細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞染色：離心收集細(xì)

14、胞，用1mlPBS1mlPBS洗細(xì)胞一次，加入洗細(xì)胞一次，加入500ulPBS500ulPBS（含（含50ug/ml50ug/ml溴化乙錠（溴化乙錠（PIPI），），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)4100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40 0C C避光孵育避光孵育3030分鐘。分鐘。 流式細(xì)胞儀檢測：一般細(xì)胞計數(shù)流式細(xì)胞儀檢測：一般細(xì)胞計數(shù)2-32-3萬個。結(jié)果用軟件萬個。結(jié)果用軟件ModfitModfit分析。分析。 細(xì) 胞 凋 亡 的 檢 測 細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化(Hoechest 3

15、3342和碘化丙啶（propidium iodide，PI） CaspasesCaspases激活激活(Caspase-3 ) 線粒體跨膜電位降低線粒體跨膜電位降低 (Rhodamine123） 膜磷脂酰絲氨酸外化膜磷脂酰絲氨酸外化(Annexin V-FITC/PI) Ca2+ Ca2+ 濃度升高濃度升高 (Fluo-3） DNADNA斷裂及含量的變化斷裂及含量的變化 (TUNEL 和 PI） Annexin-V Annexin-V 和 PI PI 雙 染 protocolprotocol 細(xì)胞用冷細(xì)胞用冷PBSPBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（binding

16、 binding bufferbuffer）中以）中以1 x 101 x 106 6 細(xì)胞細(xì)胞/mL/mL的濃度重懸的濃度重懸 吸取吸取100ul100ul的細(xì)胞的細(xì)胞(1 x 10(1 x 105 5) )至試管中。至試管中。 加進適量的熒光標(biāo)記的加進適量的熒光標(biāo)記的annexin-Vannexin-V試劑和試劑和PIPI。 混勻后避光室溫下孵育混勻后避光室溫下孵育1515分鐘。（必須在室溫下進行）分鐘。（必須在室溫下進行） 孵育后加進孵育后加進400ul400ul染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析。 Annexin-VAnnexin-V和PIPI雙染的特點和注

17、意事項 檢測特點：簡便，快速，準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。 注意事項：1.細(xì)胞制備（如貼壁細(xì)胞）和儲存時細(xì)胞膜的破損會導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS)跨膜分布的改變，造成假陽性。2.染色后立即上機檢測。Q3: 正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡細(xì)胞；Q2：晚期凋亡細(xì)胞；Q1：壞死細(xì)胞。流式細(xì)胞儀是一種特殊的顯微鏡四、細(xì) 胞 分 選 原 理 通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。（一）參 數(shù) 說 明FSFS：反映顆粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類（三）設(shè) 門 分 析 技 術(shù) 1.Gate 1.Gate

18、設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。線性門線性門PIPI染色檢測細(xì)胞周期 ProtocolProtocol 離心收集細(xì)胞，棄上清，用離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBSPBS洗細(xì)胞兩次。洗細(xì)胞兩次。 加入預(yù)冷的加入預(yù)冷的70%70%乙醇，于乙醇，于4 40 0C C固定過夜，或固定過夜，或-20-200 0C C長期固定。長期固定。 細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用1mlPBS1mlPBS洗細(xì)胞一次，加入洗細(xì)胞一次，加入500ulPBS500ulPBS（含（含50ug/ml50ug/ml溴化乙錠（溴化乙錠（PIPI），），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)4100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40 0C C避光孵育避光孵育3030分鐘。分鐘。 流式細(xì)胞儀檢測：一般細(xì)胞計數(shù)流式細(xì)胞儀檢測：一般細(xì)胞計數(shù)2-32-3萬個。結(jié)果用軟件萬個。結(jié)果用軟件ModfitModfit分析。分析。 Annexin-V Annexin-V 和 PI PI 雙 染 protocolprotocol 細(xì)胞用冷細(xì)胞用冷PBSPBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（洗滌二次并在