1、第十七章第十七章 流式細胞儀分析技術及應用流式細胞儀分析技術及應用流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。 細胞組成細胞組成細胞功能細胞功能大小大小細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細胞活性細胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞內細胞因子胞內細胞因子蛋白質含量蛋白質含量激素結合位點激素結合位點鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性采用激光作為激發光源，利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記

2、技術用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，一、工作原理 （1） 液流系統 （2） 光學系統 （3） 數據處理系統1.流式細胞儀的基本結構： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測細胞待測細胞 單個細胞的懸液單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色熒光染料標記的單抗對其染色 受受清潔氣體壓力清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流從樣品管進入流動室形成樣本流（1）液流系統鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而

3、細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。阻塞噴孔。噴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系統示意圖FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長分色反光鏡：反射長/ /短波長，通過短短波長，通過短/ /長波長長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內光透鏡組：形成平行光，除去室內光 濾片：長通、短通、帶通濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光），

4、FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）（2）光學系統FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光學系統示意圖主要由計算機及其軟件組成主要由計算機及其軟件組成（3）數據處理系統基本工作原理單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統和散射光感受系統收集光信號熒光染料被激發發光光電倍增管脈沖信號計算機系統分析結果放大垂直相交形成穩態水平激光與之基本過程區別區別流式細胞儀流式細胞儀顯微鏡顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對象對象細胞、生物粒子細胞、生物粒子細胞、組織等細胞、組織等承載

5、工具承載工具鞘液及流動室鞘液及流動室載玻片載玻片檢測信號檢測信號光學信號光學信號形態及染色形態及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學放大物鏡、光學放大統計統計計算機，計算機，50005000人工，人工，200200結果結果多參數，綜合分析多參數，綜合分析簡單，單參數簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區別 細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。二、散射光的測定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：

6、激光束照射細胞時，激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度光以相對軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號用于向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比正比。FALS SensorLaser前向散射光示意圖側向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細胞時，光以90角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。FALS Sensor90LS SensorLaser側向散射光示意圖 測得的測得的FSFS與與SSSS信號通過計算機處信號通過計算機處理，可得到理，可得到FS-SSFS-SS圖，圖，由

7、此可僅用散射光由此可僅用散射光信號對未染色的活信號對未染色的活細胞進行分析或分細胞進行分析或分選。選。 此為血細胞分此為血細胞分類的基本原理，但類的基本原理，但不能分析表面分子。不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光染料的特性熒光染料的特性激發波長(EXCITING)發射波長(EMISSION)熒光補償 通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。四、細胞分選原理細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電（一）分選基本原理 參數

8、：參數：FS,SS,FLFS,SS,FL 數據顯示方式數據顯示方式 （單參數直方圖（單參數直方圖 、雙參數散點圖、雙參數散點圖 、二維等高圖、二維等高圖 、假三維等高圖假三維等高圖 、三參數散點圖、三參數散點圖 ） 設門分析技術設門分析技術 第二節 數據的顯示與分析FSFS：反映顆粒的大小：反映顆粒的大小SSSS：反映顆粒的內部結構復雜程度：反映顆粒的內部結構復雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數量多少：反映顆粒被染上的熒光數量多少一、 參數 單參數直方圖單參數直方圖 雙參數直方圖雙參數直方圖: :點圖點圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數直方圖三參數直方圖 多參數分析

9、多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數據顯示方式 由一維參數由一維參數( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計數與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。熒光強度的顆粒數量的多少。（一）單參數直方圖單參數直方圖細胞相對數量信道(channel )1.雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度雙參數直方圖點圖 多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。光信號可根據需要進行組合分析。（四）流式細

10、胞儀的多參數分析 Gate Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設門分析技術A 淋巴細胞B 單核細胞C 中性粒細胞A、B、C均為任意門線性門Region設置設置: 區閾（區閾（region, R）與門）與門(gate, G ) 是兩個相關的概念，區閾可

11、與門對應，是兩個相關的概念，區閾可與門對應，但是也可以包含于門。但是也可以包含于門。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區域構成，即G=D1+D2+D3+D4。 樣本制備樣本制備 標記染色標記染色 液相芯片技術液相芯片技術 質量控制質量控制 第四節第四節 流式細胞儀免疫分析的技術要流式細胞儀免疫分析的技術要求求 外周血淋巴細胞樣品的制備外周血淋巴細胞樣品的制備分離單個核細胞分離單個核細胞 培養細胞的樣品制備培養細胞的樣品制備 蛋白酶消化蛋白酶消化 機械吹打機械吹打 使貼壁細胞脫落使貼壁細胞脫落 洗滌洗

12、滌 尼龍網過濾尼龍網過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備新鮮實體組織單細胞懸液的制備新鮮實體組織單細胞懸液的制備 機械法機械法 酶處理法酶處理法 化學試劑處理法化學試劑處理法 表面活性劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存單細胞懸液的保存 深低溫保存法（一年）深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周） 甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）適用條件適用條件: : 有較高的量子產額和消光系數有較高的量子產額和消光系數 對對488nm488nm的激發光波長有較強的吸收的激發光波長有較強的吸收 發射光波長與激發光波長間有較大的波長差發射光波長與激發光

13、波長間有較大的波長差 易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標記染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料名稱名稱染料染料激發激發波長波長熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對對PHPH敏感敏感性性特點特點異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素FITCFITC488488綠綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結易溶于水，與抗體結合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅Texas Texas redred568568紅紅 61561

14、5不易不易不敏感不敏感穩定，偶聯后量子產穩定，偶聯后量子產額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發光基團，消具較多發光基團，消光系數和量子產額高光系數和量子產額高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488別藻青蛋白別藻青蛋白APCAPC633633紅紅670670能量傳遞復能量傳遞復合染料合染料PEcy5PEcy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm488nm激發光照射下，激發光照射下，通過一個熒

15、光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，通過一個熒光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制第四節第四節 在免疫學檢驗中的應用在免疫學檢驗中的應用T T淋巴細胞及其亞群分析淋巴細胞及其亞群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析淋巴細胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):產生產生IgM型自身抗體型自身抗體, 參與免疫調節、參與免疫調節

16、、與自身免疫病的發生有關與自身免疫病的發生有關B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激受外來抗原刺激, 產生高親和性特異產生高親和性特異性抗體性抗體NK細胞分析細胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析 細胞介導細胞毒性試驗細胞介導細胞毒性試驗( (死細胞與活細胞比例死細胞與活細胞比例) ) 細胞內細胞因子測定細胞內細胞因子測定二、淋巴細胞功能分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例MDR(+)表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析四

17、、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測中的應用HLA-B27可出現在58%97%的強直性脊椎炎(As) 患者六、自身免疫病相關六、自身免疫病相關HLA抗原分抗原分析析 FCM作為一個強大的技術平臺，已應用于作為一個強大的技術平臺，已應用于多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越廣泛。目前移植免疫中的來越廣泛。目前移植免疫中的FCM應用主要應用主要包括流式細胞術的交叉配型（包括流式細胞術的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和）和群體反應性抗體（群體反應性抗體（Panel reactive antibody, PRA）檢測。）檢測。七、移植免疫中的應用七、移植免疫中的應用 （1） 液流系統 （2） 光學系統 （3） 數據處理系統1.流式細胞儀的基本結構： 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長分色反光鏡：反射長/ /短波長，通過短短波長，通過短/ /長波長長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內光透鏡組：形成平行光，除去室內光 濾片：長通、短通、帶通濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS