1、基因敲除技術研究進展綜述摘要：基因敲除在20世紀80年代開展起來后已經應用到許多領域,如建 立人類疾病的轉基因動物模型(糖尿病轉基因小鼠、神經缺損疾病模型等).這些 疾病模型的建立使研究者可以在動物體內進行疾病的研究 ：研究發育過程中各 個基因的功能,研究治療人類遺傳性疾病的途徑.關鍵字： 基因敲除；Cre/LoxP系統；基因載體；生物模型1 .概述：基因敲除又稱為基因打靶,是指從分子水平上將一個基因去除或替代,然 后從整體觀察實驗動物,推測相應基因功能的實驗方法,是功能基因組學研究的 重要研究工具.是自80年代末以來開展起來的一種新型分子生物學技術.通常意義上的基因敲除主要是應用 DN%源重

2、組原理,用設計的同源片段替 代靶基因片段,從而到達基因敲除的目的.隨著基因敲除技術的開展,除了同源 重組外,新的原理和技術也逐漸被應用,比擬成功的有基因的插入突變和iRNA, 它們同樣可以到達基因敲除的目的.基因敲除已成為當前醫學和生物學研究的最熱點與最前沿 ,并已對生物學 和醫學的許多研究領域產生深刻的影響,成為革命性的研究工具,具有極其重 要的理論意義和實踐意義.基于基因敲除技術對醫學生物學研究做出的重大奉獻, 在該領域取得重大進 展的三位科學家,70歲的美國人馬里奧卡佩奇(Mario Capecchi )、82歲的美 國人奧利弗史密西斯(Oliver Smithies )和66歲的英國人

3、馬丁 埃文斯(Martin Evans)分享了 2007年諾貝爾生理學或醫學獎.2 .基因敲出技術開展歷史80年代末期的基因敲除技術為第一代技術,屬完全性基因敲除,不具備時間和 區域特異性.關于第二代區域和組織特異性基因敲除技術的研究始于1993年.Tsien等于1996年在?Cell »首先報道了第一個腦區特異性的基因敲除動物, 被譽為條件性基因敲除研究的里程碑.該技術以Cre/LoxP系統為根底,Cre在哪種組織細胞中表達,基因敲除就發生在哪種組織細胞中.2000年Shimizu等于?Science?報道了以時間可調性和區域特異性為標志的第三代基因敲除技術,其同樣以 Cre/Lo

4、xP系統為根底,利用四環素等誘導 Cre 的表達.該技術使目的基因的敲除在時間上可人為限制,防止了死胎或動物出生后不久即死亡等現象的出現.2004年該實驗室Cui等又報道了第四代基因工程技術,即可誘導的區域性蛋白 質敲除技術,用這一技術構建的模式動物可在幾分鐘內反轉性地激活或敲除特定 蛋白質的功能,從根本上改變了前三代基因敲除技術對蛋白質代謝速度的內在依 賴性,到達空前的時間精度,成為目前功能基因組和功能蛋白質組研究最先進的 工具之一.然而,長期以來上述基因敲除技術只能在小鼠上完成,由于只有小鼠的ES細胞能在體外培養中無限增殖并同時保持多分化潛能.但我們知道,大鼠、家兔、 豬以及猴等大動物模型

5、在疾病研究中更接近于人類,大動物更有益于某些繁瑣的手術操作,同時血漿及組織樣本量較多,更有益于研究.3.基因敲出的一般步驟：利用基因打靶技術產生轉基因動物的程序一般為：a. ES細胞的獲得：現在基因敲除一般應用于鼠,而最常用的鼠的種系是12 9及其雜合體,由于這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向,是基因敲除的理想實驗動物.而其他遺傳背景的胚胎干細胞系逐漸被開展應用,最 近來自于C57BL/6X CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干細胞系成功地用于基因敲除. C57BL/6小鼠種系等已經廣泛的應用于免疫學領域,并以此為背景建立了許多 成功的轉基因模型.b.基因載體的構建：把目的基因和與

6、細胞內靶基因特異片段同源的DN的子都重組到帶有標記基因如neo基因,TK基因等的載體上,此重組載體即為打 靶載體.因基因打靶的目的不同,此載體有不同的設計方法,可分為替換性載體 和插入型載體.如為了把某一外源基因引入染色體 DNA勺某一位點上,這種情況 下應設計的插入型載體要包括外源基因即目的基因、同源基因片段及標記基因 等局部.如為了使某一基因失去其生理功能,這時所要設計的替換型打靶載體,應包括含有此靶基因的啟動子及第一外顯子的 DNNt段及標記基因等諸成分.c.將基因打靶載體通過一定的方式常用電穿孔法導入同源的胚胎干細胞ES cell中,使外源DNAW胚胎干細胞基因組中相應局部發生同源重組

7、,將打 靶載體中的DNAff列整合到內源基因組中從而得以表達. 一般地,顯微注射命中 率較高,但技術難度較大,電穿孔命中率比顯微注射低,但便于使用.d.用選擇性培養基篩選已擊中的細胞：一般地,篩選使用正、負選擇法,比 如用G418®選所有能表達neo基因的細胞,然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK 正常表達的細胞,剩下的細胞為命中的細胞.將篩選出來的靶細胞導入鼠的囊胚 中,再將此囊胚植人假孕母鼠體內,使其發育成嵌合體小鼠.e.通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小 鼠的生物學形狀的改變,到達研究目的基因的目的.2.實現基因敲除的不同原理和方法：2

8、. 1.利用基因同源重組進行基因敲除基因敲除是80年代后半期應用DNA同源重組原理開展起來的.80年代初, 胚胎干細胞ES細胞別離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術根底. 1985 年,首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論根底.到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型.直到現在, 運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用 方法.2.1.1利用同源重組構建基因敲除動物模型的根本步驟：a.基因載體的構建：把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因如neo基因,TK基因等的載體上,成為重

9、組載體. 基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能,所以一般設計為替換型載體.b. ES細胞的獲得：現在基因敲除一般采用是胚胎干細胞, 最常用的是鼠, 而兔,豬,雞等的胚胎干細胞也有使用.常用的鼠的種系是1 2 9及其雜合體, 由于這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向,是基因敲除的理想實 驗動物.而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被開展應用.C.同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入同源 的胚胎干細胞(ES cell)中,使外源DNAW胚胎干細胞基因組中相應局部發生同 源重組,將重組載體中的DNAff列整合到內源基因組中,從而得以表達.一般地, 顯微注射命中率較高

10、,但技術難度較大,電穿孔命中率比顯微注射低,但便于使 用.d.選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉移的同源重組自然發生率極低,動物的重組概率為10210-5,植物的概率為104105.因此如何從眾多細胞中 篩出真正發生了同源重組的胚胎干細胞非常重要.目前常用的方法是正負篩選法(PNSS),標記基因的特異位點表達法以及 PCRt.其中應用最多的是PNSfeoe.表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因 變化前后對小鼠的生物學形狀的改變,到達研究目的基因的目的.f .得到純合體：由于同源重組常常發生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩定遺傳的純合體基因敲除模型,需要進行

11、至少兩代遺傳.2.1.2同源重組實現基因敲除的新進展：2.1.2.1 條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的 細胞或發育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法.它實際上是在常規的基 因敲除的根底上,利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術,在對小鼠基因修 飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕,從而使對小鼠基因組的修飾的范圍 和時間處于一種可控狀態.條件性敲除的原理：利用Cre/LoxP和來自酵母的FLP-frt系統可以研究特定組織器官或特 定細胞中靶基因滅活所導致的表型7.通過常規基因打靶在基因組的靶位點上 裝上兩個同向排列的1oxP,并以此兩側裝接上

12、loxP的(“loxP floxed " )ES細 胞產生“ loxPfloxed 小鼠,然后,通過將“loxP floxed 小鼠與Cre轉基因 鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重組酶),產生靶基因發生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠.在“ loxP floxed 小鼠,雖然 靶基因的兩側已各裝上了一個loxP ,但靶基因并沒有發生其他的變化,故"1oxPnoxed小鼠表型仍同野生型的一樣.但當它與 Cre轉基因小鼠雜交時,產生的子代中將同時帶有“loxP floxed 靶基因和Cre基因.Cre基因表達產生的Cre 重組酶就會介導靶基因兩側的1

13、oxP間發生切除反響,結果將一個loxP和靶基 因切除.這樣,靶基因的修飾切除是以Cre的表達為前提的.Cre的表達特 性決定了靶基因的修飾切除持性：即Cre在哪一種組織細胞中表達,靶基因 的修飾切除就發生在哪種組織細胞；而Cre的表達水平將影響靶基因在此種 組織細胞中進行修飾的效率.所以只要限制Cre的表達特異性和表達水平就可實現對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度.2.1.2.2 誘導性基因敲除法誘導性基因敲除也是以Cre/loxp系統為根底,但卻是利用限制Cre表達的 啟動子的活性或所表達的 Cre酶活性具有可誘導的特點,通過對誘導劑給予時 間的限制或利用Cre基因定位表達系統中載體的宿主細

14、胞特異性和將該表達系 統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性,從而在1oxP動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術.人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進 行人為限制、以防止出現死胎或動物出生后不久即死亡的現象.常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型. 誘導性基因敲除優點： 誘導基因突變的時間可人為限制； 可防止因基因突變而致死胎的問題在2個loxP位點之間的重組率較高；如用病毒或配體/ DNA復合物等基因轉移系統來介導 Cre的表達,那么可 省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過

15、程.2.2 利用隨機插入突變進行基因敲除.2.2.1 原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒, 細菌或其他基因載體,在目標細 胞基因組中進行隨機插入突變,建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫, 然后通過 相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞. 根據細胞的不同,插入載體的選 擇也有所不同.逆轉率病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農桿菌 介導的T-DNA轉化和轉座子比擬常用；噬菌體可用于細菌基因敲除插入了靶目標的基因轉錄譯出無活性的目標蛋白隨機插入內含子中需要 敲除的靶基因轉錄譯出活性蛋白2.2.2 基因捕獲法基因捕獲法是最近開展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法, 其原理

16、可見圖6.通常基因捕獲載體還包括一個無啟動子的報道基因, 通常是neo 基因,neo基因插入到ES細胞染色體組中,并利用捕獲基因的轉錄調控元件實 現表達的ES克隆可以很容易地在含 G418的選擇培養基中篩選出來,從理論上 講,在選擇培養基中存活的克隆應該 100%地含有中靶基因.中靶基因的信息可 以通過篩選標記基因側翼cDNAE染色體組序列分析來獲得2.2.3 基因捕獲法的優缺點用常規方法進行基因敲除研究需消耗大量的時間和人力,研究者必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關的染色體組克隆,繪制相應的物理圖譜,構建特異性的基因敲除載體以及篩選中靶 ES細胞等,通常一個基因剔除純合子小鼠的 獲得需要

17、一年或更長的時間.面對人類基因組方案產生出來的巨大的功能未知的 遺傳信息,傳統的基因敲除方法顯得有些力不從心.因此,基因捕獲法應運而生, 利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫,節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用,更有效和更迅速地進行小鼠染色 體組的功能分析.此方法的缺點是只能剔除在 Es細胞中表達的基因.單種的 細胞類型中表達的基因數目約為I04 ,現在的基因捕獲載體從理論上來講應能剔 除所有在ES細胞表達的基因,因此,在ES細胞中進行基因捕獲還是大有可為的.用基因捕 獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾,2.3 .RNAi引起的基因

18、敲除.由于少量的雙鏈RNA能阻斷基因的表達,并且這種效應可以傳遞到子代細 胞中,所以RNAi的反響過程也可以用于基因敲除. 近年來,越來越多的基因敲除 采用了 RNAi這種更為簡單方便的方法.2.3.1 RNAi阻斷基因表達的機理雙鏈RNA8入細胞后,能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA,而另一方 面雙鏈RNA®能在RdRP 以RNAJ模板指導RN貽成的聚合酶RNA-directedRNApolymerase , RdRP的作用下自身擴增后,再被Dicer酶裂解成siRNA.SiRNA 的雙鏈解開變成單鏈,并和某些蛋白形成復合物,Argonaute2是目前唯一的參與復合物形成

19、的蛋白.此復合物同與siRNA互補的mRNAg合,一方面使mRNA 被RNAS裂解,另一方面以SiRNA作為引物,以mRNAfe模板,在RdRP乍用下合 成出mRNA勺互補鏈.結果mRN也變成了雙鏈RNA它在Dicer酶的作用下也被 裂解成siRNA.這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用,通過這個聚合酶 鏈式反響,細胞內的siRNA大大增加,顯著增加了對基因表達的抑制.從 21到 23個核甘酸的siRNA到幾百個核甘酸的雙鏈 RNAtB能誘發RNAi,但長的雙鏈RNA 阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA2.3.2 RNAi基因敲除的優點及應用比用同源重組法更加簡便,周期大大縮短

20、.對于哺乳動物,如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因,可以在體外培養的細胞中利用RNAi技術研究它的功能.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達,它成為研究信號傳導通路的良 好工具.RNAi還被用來研究在發育過程中起作用的基因,如可用RNAi來阻斷某些基因的表達,來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關鍵作 用.2.3.3 RNAi基因敲除的缺點RNAf擾技術存在許多問題,使它不能完全替代基因敲除技術：1 .RNAi不適用于所有的細胞,而基因敲除技術那么可以作用于個體胚胎發育 各個介段,能精確地敲除任何組織或器官的目的基因；2 .RNAi在低等生物中能高效誘發基因沉默,但是在

21、哺乳動物中,RNAi的抑制效果遠遠不如在低等生物體中那么明顯,而基因敲除對哺乳動物的效果也是明 顯的；3 .基因敲除得到的動物模型具有遺傳性,能夠進行繁殖而獲得大量的基因敲 除動物群體,有利于實驗的延續,而 RNAi的基因沉默是沒有遺傳性的.4 .4實現基因敲除的其他原理.除上述幾種已經比擬成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外, 還有一些基于 其他原理的敲除技術正處于研究和完善過程中,如 TFOs(Triple helix forming oligonucleotides )引導的基因敲除術以及反義技術在基因敲除技術中的運用等.隨著遺傳學,分子生物學理論的開展,新的基因敲除原理也在不斷的發現和開

22、掘 中.3 .基因敲除技術的應用及前景：建立生物模型基因敲除動物模型的建立,為研究人類疾病提供了一個嶄新的方法,如：通過敲除小鼠的OA1基因用來研究人類眼球白化癥.在藥物依賴性研究中基因敲除 技術也發揮了重要作用,利用基因敲除技術培育出了先天性缺失某一特定受體基 因的動物用于研究該受體所發揮的作用,如：通過基因敲除技術培育出阿片小、 八K三種亞型受體基因缺陷小鼠用于研究嗎啡產生的精神依賴性史由什么受體 介導的.在基因功能,代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要.基因敲除技術就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型,從而進行相關的研究.這些模 型可以是細胞,也可以是完整的動植物或微生物個體.最常

23、見的是小鼠,家兔、 豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報道.疾病的分子機理研究和疾病的基因治療在對羅格列酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響的實驗中發現,羅 格列酮可以抑制動脈粥中¥硬化病變的開展；2021年張風河等應用敲除技術研究 p75神經營養蛋白受體及印尼敲除對小鼠面神經損傷后神經再生的影響,結果發現可以增強面神經的再生通過基因敲除技術可以確定特定基因的性質以及研究 它對機體的影響.這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有 重大的意義.提供廉價的異種移植器官眾所周知,器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素,而大量廉價的異種生物如豬等的器官卻

24、不能用于人體. 這是由于異源生物的基因會產生一些 能引起人體強烈免疫排斥的異源分子,如果能將產生這些異源分子的基因敲除, 那么動物的器官將能用于人體的疾病治療, 這將為患者帶來具大的福音.如：PPL Therapeutics 公司于1999年已成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術敲除了 a-1, 3GT基因.使每只豬都缺乏產生 al - 3半乳糖基轉移酶的基因的2個拷貝.這些酶在細胞外表產生一種糖分子, 人體的免疫系統可以立即識別出這種糖分子為異源性,從而引發超急性免疫排斥反響. 在缺乏這種酶的情況下,超急性排斥反響即不會再發生.免疫學中的應用同異源器官移植相似,異源的抗體用于人體時或多或少會有

25、一定的免疫排斥, 使得人用抗體類藥物的生產和應用受阻.而如果將動物免疫分子基因敲除,換以 人的相應基因,那么將產生人的抗體,從而解決人源抗體的生產問題.改造生物、培育新的生物品種作為一項新興的微生物育種技術,基因敲除克服了傳統誘變方法的盲目性和 偶然性,敲除后改變的基因會隨染色體 DNA!行復制,改進的菌種可以穩定地用 于后續的研究和生產.這樣的方法具有很強的目的性,大大節省了為生物技術研 究的時間.細菌的基因工程技術是本世紀分子生物學史上的一個重大突破,而基因敲除技術那么可能是遺傳工程中的另一重大飛躍.它為定向改造生物,培育新型生物提供了重要的技術支持.4 .基因敲除技術的缺陷隨著基因敲除技術的開展,早期技術中的許多缺乏和缺陷都已經解決,但 基因敲除技術始終存在著一個難以克服的缺點,即敲掉一個基因并不一定就能獲 知該基因的功能,其原因包括：一方面,許多基因在功能上是冗余的,敲掉一個在功能上冗余的基