1、Chapter three Techniques of genetic engineering六六. Different ramificate(衍生的）衍生的）methods of PCR1、熱啟動、熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之特異性最重要的方法之一。一。 原因：盡管原因：盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，溫仍然有活性。因此，PCR反應體系配制過程中，以及在熱循環剛開始，反應體系配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。

2、這些非特異性產物一旦保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。形成，就會被有效擴增。 對策：對策： 限制限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將反應液，并將其置于預熱的其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到合成，直到PCR儀達到變性溫度。儀達到變性溫度。 包括包括延

3、緩加入延緩加入Taq DNA聚合酶聚合酶; 使用使用蠟防護層蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開物理地隔離開。在熱循環時，因蠟。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起; 聚合酶的活性需經過聚合酶的活性需經過 95 10mins 的高溫造成化學修飾基團的的高溫造成化學修飾基團的脫落，然后才有聚合的活性脫落，然后才有聚合的活性. 2、Touch-down PCR Touch-down PCR又稱降落又稱降落PCR。即選定一

4、個溫度范。即選定一個溫度范圍，如圍，如6550 ，每降，每降1-2 進行進行1-2個循環，然后個循環，然后在在50度下進行度下進行15個循環。個循環。 Touch-down的原理：隨著退火溫度的降低，特異的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經擴增出性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經擴增出來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優先被擴增。降低，特異性條帶優先被擴增。 選擇初始復性溫度的原則：起始復性溫度應該比引選擇初始復性溫度的原則：起始復性溫度應該比引物的物的Tm值高出值高出5-10度

5、，然后每個循環遞減度，然后每個循環遞減1-2度度Touch-down PCR的應用范圍的應用范圍vlow copy of targeted DNA; vhigh degree degeneracy (or less specific) of the set of primers; vRT-PCR using oligo-dT.3、巢氏、巢氏PCR（Nested PCR）v 巢氏巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴增需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴增15-30個循環，再用擴增個循環，再用擴增DNA片段內設定的第二套引物擴片段內設定的第二套引物擴增增15-30個循環，這樣可使待擴

6、增序列得到高效擴增，而個循環，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級序列卻很少擴增。套式引物次級序列卻很少擴增。套式引物PCR減少了引物非特異性減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。v 若將巢氏若將巢氏PCR的內外引物稍加改變，延長外引物長度的內外引物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時縮短內引物長度（），同時縮短內引物長度（15-17bp），使外），使外引物先在高退火溫度下復性，做雙溫擴增，使內引物在外引物先在高退火溫度下復性，做雙溫擴增，使內引物在外引物擴增的基礎上，在低退火溫度復性，直到擴增完成，引物擴增的基

7、礎上，在低退火溫度復性，直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。這樣就可以使兩套引物一次同時加入。4、原位PCRv 原位原位PCR就是在組織細胞里進行就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的雜交和高度特異敏感的PCR技術的優點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一技術的優點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術項有較大潛力的新技術.v 原位原位PCR是是Hasse等于等于1990年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等織、脫落細

8、胞、血細胞等.v 其基本方法為固定細胞其基本方法為固定細胞:將組織細胞固定于預先用四氟乙烯包被的玻片上，并將組織細胞固定于預先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，滅活除去細胞內源性過氧化物酶用多聚甲醛處理，滅活除去細胞內源性過氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K消化處理消化處理:用用60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶K將固定好的組織細胞片將固定好的組織細胞片55消化處理消化處理2h后，后，962min以滅以滅活蛋白酶活蛋白酶K.PCR擴增擴增:在組織細胞片上，加在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋并加液體石蠟后，反應液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行直接放在擴增儀的金屬板上，進行PC

9、R循環擴增循環擴增.有的基因擴增儀帶有專門用于有的基因擴增儀帶有專門用于原位原位PCR的裝置的裝置.雜交雜交:PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交交.顯微鏡觀察結果顯微鏡觀察結果.v 原位原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實于分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值用價值.其特異性和敏感性高于一般的其特異性和敏感性高于一般的PCR. 6、免疫、免疫

10、-PCR(immuno-PCR)v 免疫免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統檢測系統.它利用抗原它利用抗原-抗體反應的特異性和抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測.v 免疫免疫-PCR試驗的主要步驟有三個試驗的主要步驟有三個:抗原抗原-抗體反應，與抗體反應，與嵌合連接分子結合，嵌合連接分子結合，PCR擴增嵌合連接分子中的擴增嵌合連接分子中的DNA(一般一般為質粒為質粒DNA).該技術的關鍵環節是嵌合連接分子的制備該技術的

11、關鍵環節是嵌合連接分子的制備.在免疫在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒DNA結合，其結合，其基本原理與基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質粒記物不是酶而是質粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體，在操作反應中形成抗原抗體-連接連接分子分子-DNA復合物，通過復合物，通過PCR擴增擴增DNA來判斷是否存在特異性來判斷是否存在特異性抗原抗原.v 免疫免疫PCR優點為

12、優點為:特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上特異性反應的基礎上.敏感度高，敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，具有驚人的擴增能力，免疫免疫PCR比比ELISA敏感度高敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢倍以上，可用于單個抗原的檢測測.操作簡便，操作簡便，PCR擴增質粒擴增質粒DNA比擴增靶基因容易得多，比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行一般實驗室均能進行 v自從自從1988年，年，Chamberlain研究表明研究表明PCR可以同可以同時擴增人類肌營養不良蛋白基因多個基因座以來，時擴增人類肌營養不良蛋白基因多個基因座以來，多重多重PCR技

13、術得到研究人員的廣泛關注，并且已技術得到研究人員的廣泛關注，并且已經逐漸發展成為一種通用技術。如今，多重經逐漸發展成為一種通用技術。如今，多重PCR技術已經廣泛的應用于病原體鑒定、性別篩選、技術已經廣泛的應用于病原體鑒定、性別篩選、連鎖分析、法醫研究、模板定量和遺傳疾病診斷連鎖分析、法醫研究、模板定量和遺傳疾病診斷之中。之中。 7、多重PCR 多重多重PCR（multiplex polymerase chain reaction， MPCR）也稱為）也稱為復合復合PCR，是在常規，是在常規PCR的基礎之上進行改進從而發展起來的一種新型的的基礎之上進行改進從而發展起來的一種新型的PCR擴增技術，

14、多重擴增技術，多重PCR技術的基本原理與常規的技術的基本原理與常規的PCR技術相同。技術相同。 多重多重PCR技術主要有兩種形式：一、將多條引物和多個模板技術主要有兩種形式：一、將多條引物和多個模板DNA混合在同一個混合在同一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，常用于突變缺失檢測、多態分析等；反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，常用于突變缺失檢測、多態分析等；二、將多條引物和單一的模板二、將多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片段，常用于對超長片段的擴增。片段，常用于對超長片段的擴增。v 多重多重PCR的優點：高效性，在同

15、一的優點：高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，且所需模板或樣品量極少，應物，或對有多個型別的目的基因進行分型，且所需模板或樣品量極少，應用一滴血就可檢測多種病原體。系統性，多重用一滴血就可檢測多種病原體。系統性，多重PCR很適宜對癥狀相同或很適宜對癥狀相同或容易污染相同食品的一組病原菌進行分析，即適宜對成組病原體進行檢測，容易污染相同食品的一組病原菌進行分析，即適宜對成組病原體進行檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰

16、劑的同時檢測經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，菌戰劑的同時檢測經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床或食品安全檢測提將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床或食品安全檢測提供更多更準確的診斷信息。供更多更準確的診斷信息。v 多重多重PCR的不足：靈敏性和檢測的特異性低的不足：靈敏性和檢測的特異性低 需要優先擴增某一特定需要優先擴增某一特定片段片段 容易形成引物二聚體。多重容易形成引物二聚體。多重PCR要求不同的引物能在同一反應體要求不同的引物能在同一反應體系中進行各自的特異性擴增，但是它的體系建立和條件優化過程需要較長

17、系中進行各自的特異性擴增，但是它的體系建立和條件優化過程需要較長的時間，所以在一定程度上限制了該方法的推廣應用。的時間，所以在一定程度上限制了該方法的推廣應用。v面臨的問題：面臨的問題： 在多重在多重PCR的反應體系中，由于涉的反應體系中，由于涉及到的引物比較多，因此比較容易造成引物二聚及到的引物比較多，因此比較容易造成引物二聚體、錯配和非特異性擴增等現象，從而降低擴增體、錯配和非特異性擴增等現象，從而降低擴增反應的效率。所以在建立一個多重反應的效率。所以在建立一個多重PCR反應體系反應體系的時候，需要對設計的引物，反應體系的組成和的時候，需要對設計的引物，反應體系的組成和PCR循環條件等進行

18、反復的摸索，并進行優化。循環條件等進行反復的摸索，并進行優化。8.反向反向PCR： 常規常規PCR只能擴增兩個引物之間的只能擴增兩個引物之間的DNA區段，但有時我們想知道基因之外的兩側未區段，但有時我們想知道基因之外的兩側未知知DNA序列，這樣就出現了反向序列，這樣就出現了反向PCR。反向反向PCR首先將首先將DNA用限制性內切酶切割，切割要保持已知序列兩端有未知序列，用限制性內切酶切割，切割要保持已知序列兩端有未知序列，進行環化，然后用引物進行擴增。產物是已知序列以外的序列。進行環化，然后用引物進行擴增。產物是已知序列以外的序列。9.PCRRFLP(restriction fragment

19、length polymorphism) 是一種借助于限制性內切酶對是一種借助于限制性內切酶對PCR擴增片斷進行酶切分析的方法。用于鑒定分類。擴增片斷進行酶切分析的方法。用于鑒定分類。基因有保守區，有可變區，我們可以依據保守區設計共同的引物，然后用酶進行酶切分析，不同的物種基因有保守區，有可變區，我們可以依據保守區設計共同的引物，然后用酶進行酶切分析，不同的物種的酶切分析圖不同，這種圖譜也叫指紋圖譜。的酶切分析圖不同，這種圖譜也叫指紋圖譜。可變可變保守10. PCR定點誘變：定點誘變：法的原理也是利用人工合成帶突變位點的誘變引物，通過擴增而獲法的原理也是利用人工合成帶突變位點的誘變引物，通過擴

20、增而獲得定點突變的基因或片段。得定點突變的基因或片段。PCR定點誘變法可分為重組定點誘變法可分為重組PCR定點誘變法和定點誘變法和大引物誘變法兩種。大引物誘變法兩種。 靶 D N A 片 斷 (a) 3 5 5 3 引 物 A 引 物 A (b) 3 5 5 3 5 3 3 5 引 物 B 引 物 C 3 5 5 3 5 3 3 5 (c) 混 合 ， 變 性 ， 退 火 5 3 不 能 擴 增 3 55 3 3 5 可 擴 增 DNA pol 5 3 3 5 (d) 用 引 物B和C作 PCR 5 3 3 5 5 3 PCR 3 5 多次循環 5 3 3 5 PCR 大引物 3 5 PCR

21、3 5 5 3 大引物誘變法四、脈沖電場凝膠電泳（四、脈沖電場凝膠電泳（PFGE） 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到合成，直到PCR儀達到變性溫度。儀達到變性溫度。 包括包括延緩加入延緩加入Taq DNA聚合酶聚合酶; 使用使用蠟防護層蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開物理地隔離開。在熱循環時，因蠟。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起; 聚合酶的活性需經過聚合酶的活性需

22、經過 95 10mins 的高溫造成化學修飾基團的的高溫造成化學修飾基團的脫落，然后才有聚合的活性脫落，然后才有聚合的活性. v 多重多重PCR的優點：高效性，在同一的優點：高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，且所需模板或樣品量極少，應物，或對有多個型別的目的基因進行分型，且所需模板或樣品量極少，應用一滴血就可檢測多種病原體。系統性，多重用一滴血就可檢測多種病原體。系統性，多重PCR很適宜對癥狀相同或很適宜對癥狀相同或容易污染相同食品的一組病原菌進行分析，即適宜對成組病原體進行檢測，容易污染相同食品的一組病原菌進行分

23、析，即適宜對成組病原體進行檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時檢測經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，菌戰劑的同時檢測經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床或食品安全檢測提將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床或食品安全檢測提供更多更準確的診斷信息。供更多更準確的診斷信息。v 多重多重PCR的不足：靈敏性和檢測的特異性低的不足：靈敏性和檢測的特異性低 需要優先擴增某一特定需要優先擴增某一特定片段片段 容易形成引物二聚體。多重容易形成引物二聚體。多重PCR要求不同的引物能在同一反應體要求不同的引物能在同一反應體系中進行各自的特異性擴增，但是它的體系建立和條件優化過程需要