1、生物化學實驗手冊學時：36 學分：1.5課程屬性：專業必修課 開課單位：華僑大學生物醫學學院 先修課程：高等數學、普通物理學、無機及分析化學、有機化學一、課程的性質與任務 生物化學實驗課是在學習生物化學理論課的基礎上進行的一個實踐性環節，本課程的教學任務是讓學生運用已學過的知識驗證一些結論、結果和現象，及綜合運用已學過的理論知識設計實驗或進行綜合性的實驗，鞏固和加深對生物化學課程中基本理論知識的理解，訓練學生理論知識的運用能力、實驗操作技能、實驗數據的處理和分析能力。二、實驗目的與基本要求本實驗課配合理論教學，通過實驗從實踐中進一步學習，掌握和運用學過的基本理論；運用生物化學理論分析實驗過程中

2、的各種現象和問題，培養、訓練學生的分析和解決問題的能力。學生必須完成的基本要求：預習實驗，準備實驗；寫出預習報告，擬定記錄表格；測取實驗數據；整理實驗數據；寫出實驗報告。三、實驗項目一覽表生物化學實驗項目一覽表序號實驗項目名稱實驗類型實驗要求適用專業學時12345678910111213氨基酸的分離鑒定紙層析法紫外分光光度法測定蛋白質的含量Bradford法測定蛋白質的含量Folin-酚法測定蛋白質的含量垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質脲酶的動力學研究用正交法測定幾種因素對酶活性的影響DNA的提取與測定瓊脂糖凝膠電泳實驗還原糖和總糖的測定可溶性糖的硅膠G薄層層析維生素C含量的定量測定卵磷脂的

3、提取、純化和鑒定基礎性基礎性基礎性基礎性綜合性基礎性基礎性綜合性綜合性基礎性基礎性基礎性設計性必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類生物醫學類3222622333323四、實驗考核方式及辦法考核方式：考查和實驗成績。 實驗考查成績占總成績的30%。 實驗成績占總成績的70%。實驗成績評分辦法：實驗操作占40%，實驗態度占20%，實驗報告占40%。五、實驗項目的具體內容。實驗一：氨基酸的分離鑒定紙層析法一、實驗目的通過對氨基酸的分離，學習運用紙層析法分離氨基酸混合

4、物的基本原理，掌握紙層析的操作方法。二、實驗原理紙層析（Paper Chromatography，簡稱PC），是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上有親水性的羥基，通過吸附一層水作為固定相，通常把有機溶劑作為流動相。有機溶劑自上而下流動稱為下行層析，自下而上流動稱為上行層析。流動相流經支持物時，與固定相之間連續抽提，使物質在兩相間不斷分配而得到分離。物質被分離后在紙層析圖譜上的位置用Rf值（比移值）來表示：Rf值 = 原點到層析點中心的距離/ 原點到溶劑前沿的距離在一定條件下某種物質的Rf值是常數，其大小受物質的結構、性質、溶劑系統物質組成與比例、pH值、選用濾紙質地和溫度等多種因素影響

5、。此外，樣品中的鹽分、其他雜質以及點樣過多均會影響的有效分離。無色物質的紙層析圖譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定，氨基酸紙層析圖譜常用茚三酮或吲哚醌作為顯色劑，本實驗采用茚三酮作為顯色劑。三、儀器與試劑 （一）實驗器材（1）層析缸 （2）微量器槍頭（3）噴霧器（4）培養皿（5）電吹風機 （6）層析濾紙 （7）直尺（二）實驗試劑（1）擴展劑：4份水飽和的正丁醇和1份冰乙酸的混合物。將20毫升正丁醇與5毫升冰乙酸放入分液漏斗中與15毫升水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層，取漏斗內的擴展劑約5毫升置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養皿中備用。（2）氨基酸溶液：2mg/mL的賴氨酸、甘

6、氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液以及它們的混合液。（3）顯色劑：0.5%水合茚三酮正丁醇溶液。四、操作步聚1. 將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中，取長22厘米，寬14厘米的層析濾紙一張，在濾紙的一端距邊緣2-3厘米處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2厘米作一記號，等待點樣。2. 點樣：用毛細管將各氨基酸樣液分別點在7個位置上，注意一定要每個點用一個毛細管，避免混用污染。樣點干燥后再點2-3次，每點在濾紙上的擴散直徑范圍在3毫米內為最佳。3. 擴展：用針線將濾紙縫成圓筒狀，注意紙的兩邊不能接觸，留一定縫隙。將盛有約20毫升擴展劑的培養皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙垂直立于培

7、養皿中，點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1厘米，待溶劑上升至距離濾紙上端2厘米左右時取出濾紙，用鉛筆在溶劑前沿劃一邊界線，自然干燥或用電吹風機吹干溶劑。4. 顯色：用噴霧器均勻噴上0.5%茚三酮正丁醇溶液，然后置100烘箱烘烤5分鐘或用電熱風吹干即可顯出各層析斑點。5. 計算各種氨基酸的Rf值。五、思考題為什么不同的氨基酸有不同的Rf值，影響本實驗Rf值精確性的因素有哪些？實驗二： 紫外分光光度法測定蛋白質的含量一、實驗目的了解紫外吸收法測定蛋白質的含量的原理，掌握紫外分光光度的使用方法以及紫外分光光度法測定蛋白質含量的方法。二、實驗原理蛋白質分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使

8、蛋白質對280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內，蛋白質溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測定。該法操作簡單、快捷，并且測定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測定，故在蛋白質和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點：1當待測的蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大是會產生一定的誤差，故該法適用于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的樣品。2若樣品中含有其他在280nm吸收的物質如核酸等化合物，就會出現較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過計算可以適當的消除核酸對于測定蛋白質濃度的干擾作用。但因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不同

9、的，雖經校正，測定結果還存在著一定的誤差。三、實驗器材1紫外分光光度計 2移液管 3試管及試管架 4石英比色皿四、材料與試劑1標準蛋白質溶液：準確稱取經凱氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成濃度為1mg/mL的溶液。2待測蛋白溶液：酪蛋白稀釋溶液，使其濃度在標準曲線范圍內。五、操作方法1標準曲線的制作表1 標準曲線的制作管號12345678標準蛋白質溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.0蒸餾水/mL43.53.02.52.01.51.00蛋白質濃度/（mg/mL）00.1250.250.3750.500.6250.751.00A280A260按表1加入試劑。混勻后, 選用1cm的石

10、英比色皿，在波長280nm處測定各管的吸光值。以蛋白質的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出血清蛋白的標準曲線。2未知樣品的測定取待測蛋白質溶液1mL，加入3mL蒸餾水，在280nm下測定其吸光度值。并從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度。實驗三： Bradford法測定蛋白質的含量一、實驗目的學習考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質濃度的原理和方法。二、實驗原理1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合的原理，迅速而準確的定量蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變為595nm。蛋白質-染料復合物具有高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的

11、靈敏度（最低檢出量為1g）。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程，大約只需2min，結合物的顏色在1h內是穩定的。一些陽離子（如K+，Na+，Mg2+），（NH4）2SO4，乙醇等物質不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。由于染色法簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高，現已廣泛用于蛋白質含量的測定。三、實驗器材1天平 2分光光度計 3試管及試管架 4比色皿 5移液管四、材料與試劑1考馬斯亮藍G-250：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000mL。試劑

12、的終含量為：0.01%考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。2標準蛋白質溶液：可用牛血清白蛋白預先經凱氏定氮法測定蛋白含氮量，根據其純度配制成1mg/mL的溶液。3未知樣品液。五、操作方法1. 牛血清蛋白標準曲線的制作表2 牛血清蛋白標準曲線的制作試管號123456標準蛋白液/mL00.20.40.60.81.0水/mL10.80.60.40.20每管中所含標準蛋白質的量/mg02004006008001000G-250染色液/mL555555室溫下靜置2minA595取6支試管，編號為1、2、3、4、5、6，按表2加入試劑。混勻后靜置2min，以1號管作空白

13、對照,測定各管595nm下的吸光值，以吸光植為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線。2未知樣品中蛋白質的測定取未知濃度的蛋白液（通過適當稀釋，使其濃度控制在0.015-0.1mg/mL范圍內）加到1mL試管內，再加入G-250染色液5mL混勻，測其595nm下的吸光度，對照標準曲線求出未知蛋白液的濃度。六、思考題1比較兩種方法的測定結果, 分析紫外法和Bradford法測定蛋白質含量的各自有哪些優點和缺點？2若樣品中含有核酸雜質，紫外法測定時應如何排除干擾？實驗四：Folin-酚法測定蛋白質的含量一、實驗目的學習Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法。進一步掌握比色法或分光光度法在實

14、際測量中的應用和注意事項。二、實驗原理 Folin-酚試劑法是測定蛋白質含量的經典方法，它是在雙縮脲法的基礎上發展而來的。它操作簡單、迅速、靈敏度高，叫雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當于雙縮脲試劑。蛋白質中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應形成銅-蛋白質復合物。這個復合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發生氧化還原反應。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍色反應。而蛋白質中的酪氨酸和色氨酸均可發生此呈色反應。顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色法測定蛋白質的含量。此法易受蛋白質樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH

15、值時穩定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質溶液時，必須立即混合均勻。以確保還原反應能正常發生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測定。三、實驗器材 試管及試管架。 分光光度計。 吸管：0.5ml、1ml、5ml。四、材料與試劑 Folin酚試劑甲：A：10g Na2CO3、 2g NaOH和0.25 g 酒石酸鉀鈉，溶解定溶至500 ml， B：0.5g硫酸銅溶于100ml溶液中，使用當天將50ml A和1ml B混合即得溶液（甲）。有效期為1天。 Folin酚試劑乙（購買）。 牛血清蛋白（250g/ml）。 未知蛋白溶液：生物材料或樣品，配制成溶液。五、操作方法 標準曲線的繪制 表1 血清白

16、蛋白標準曲線制作管號123456牛血清白蛋白/mL 00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL10.80.60.40.20每管所含牛血清白蛋白的含量g/mL050100150200250Folin酚試劑甲/mL555555室溫下放置10minFolin酚試劑乙/mL0.50.50.50.50.50.5OD650取7支試管，做好標記，按表1加入試劑。將各管混合均勻，室溫下放置10min。再各加入0.5 mL Folin酚試劑乙，混合均勻，30min后，以1號管作空白， 650nm波長下測定各管的吸光度，以吸光度為縱坐標，以牛血清白蛋白溶液為橫坐標，繪制出牛血清白蛋白的標準曲線。 樣品的測定準確

17、吸取樣品0.2ml，再加入0.8ml蒸餾水使樣品體積達到1ml，加入5ml Folin酚試劑A15min后，再加Folin酚試劑B0.5ml，放置30min后，以0號管為空白，于500nm波長下測定吸光度由標準曲線查出樣品的蛋白質濃度。六、思考題1. 試述Folin酚法的優缺點。2. 比較紫外分光光度法與比色法的異同。實驗五：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質一、實驗目的 學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分離蛋白質的原理和基本操作技術。二、實驗原理 蛋白質是兩性電解質，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當溶液的pH大于蛋白質的等電點(pI)時，蛋白質本身帶負電，在電場中將向正

18、極移動；當溶液的pH小于蛋白質的等電點時，蛋白質帶正電，在電場中將向負極移動；蛋白質在特定電場中移動的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質顆粒的大小和分子形狀、電場強度等。 聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網狀孔結構。本實驗采用不連續凝膠系統，調整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠；這樣，當含有不同分子量的蛋白質溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質分子在通過大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當進入小孔膠時，分子量大的蛋白質移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮

19、成很窄的區帶。這就是常說的濃縮效應和分子篩效應。同時，在制備上層膠(濃縮膠)和下層膠(分離膠)時，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.76.8，下層膠pH8.9；TrisHCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對離子；CI-是前導離子。在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH8.9時，Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續性，控制了慢離子的解離度，進而達到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質具有不同的等電點，在進入分離膠后，各種蛋白質由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應，分子篩效應及電荷效應，使不同的蛋白

20、質在同一電場中達到有效的分離。 如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)，由于SDS帶有大量的負電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質變性，特別是在強還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質分子內的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質分子與SDS充分結合，形成帶負電性的蛋白質SDS復合物；此時，蛋白質分子上所帶的負電荷量遠遠超過蛋白質分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質間所帶電荷上的差異。蛋白質分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。蛋白質的分子量與電泳遷移率之間的關系是：Mr=K(10-b·m) logMr=LogKb·Rm，式中： Mr 蛋白質的分子量；lo

21、gK截距；b斜率；Rm 相對遷移率。實驗證明，蛋白質分子量在15,000200,000的范圍內，電泳遷移率與分子量的對數之間呈線性關系。蛋白質的相對遷移率Rm蛋白質樣品的遷移距離染料(溴酚藍)遷移距離。這樣，在同一電場中進行電泳，把標準蛋白質的相對遷移率與相應的蛋白質分子量對數作圖，由未知蛋白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離蛋白質具有簡便、快速、重復性好的優點，是目前一般實驗室常用的分離鑒定蛋白質的方法。三、試劑及主要器材1主要試劑1) 標準蛋白混合液內含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌動蛋白

22、(Mw 43,000)，磷酸酐酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000)2) 30凝膠貯備液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸餾水至100mL3) 分離膠緩沖液(1.5molL): Tris 18.15g, 加水溶解, 6mol/L HCl調pH8.9, 定容100mL4) 濃縮膠緩沖液(0.5molL): Tris 6g, 加水溶解，6mol/L HCl調pH6.8，并定容到100mL5) 電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用時稀釋五倍。6) 10SDS 7) 10過硫酸銨(新鮮配制) 8) 1TEME

23、D9) 上樣緩沖液： 0.5molL Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50甘油4mL，10SDS 2mL，巰基乙醇0.4mL，0.1溴酚藍0.4mL，加蒸餾水定溶至10mL。10) 0.25考馬斯亮藍R-250染色液：考馬斯亮藍R-250 1.25g，50甲醇454mL，冰乙酸46mL。11) 脫色液：冰乙酸 35mL，蒸餾水465 mL。12) 未知分子量的蛋白質樣品(1mgmL )2實驗器材DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)；電泳儀；長滴管；微量加樣器；燒杯(250mL、500m1)；量筒(500mL、 250m1)；培養皿(15cm´l5cm); 注射

24、器等。四、實驗操作1. 裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內，然后插入斜插板到適中程度, 即可灌膠。2. 凝膠的聚合 分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10的分離膠和4.8的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠/mL4.8%的濃縮膠/mLAcr/Bis 30%分離膠緩沖液（pH8.9）濃縮膠緩沖液（pH6.8）10%SDS10%過硫酸銨水TEMED53.7500.150.1511.601.250.10.14.951按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內面緩緩用滴管滴入，

25、小心不要產生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止,約5mL。然后用細滴管或注射器仔細注入少量水,約0.5-1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(梳子)；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。3蛋白質樣品的處理 若標準蛋白質或欲分離的蛋白質樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL 0.5molL pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中；若樣品是液體，要測定蛋白質濃度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白質樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣品為1520mg的標準蛋白樣品溶液，

26、放置在0.5mL的離心管中，加入1520ml的樣品處理液。在100水浴中處理2min，冷卻至室溫后備用。 吸取未知分子量的蛋白質樣品20ml，按照標準蛋白的處理方法進行處理。加樣4SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框,注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜板,將緩沖液加至內槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可,注意避免在電泳槽內出現氣泡。 加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內，以準確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內加樣，各加1015ml(

27、含蛋白質1015mg)，稀溶液可加2030ml (還要根據膠的厚度靈活掌握)。 5電泳 加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關后，樣品進膠前電流控制在1520mA，大約1520min；樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后，電流升到3045mA，電泳過程保持電流穩定。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約1-2小時。如室溫高，打開電泳槽循環水，降低電泳溫度。6染色、脫色 電泳結束后，關掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區帶中心插入銅絲作為標志，放入大培養皿中染色，使用0.25的考馬斯亮藍染液，染色2

28、4h，必要時可過夜。 棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經常換脫色液，直至蛋白質帶清晰為止。7結果處理1) 測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質樣品移動距離(即蛋白質帶中心到加樣孔的距離)，測量指示染料遷移的距離。2) 按以下公式計算蛋白質樣品的相對遷移率(Rm)相對遷移率樣品遷移距離(cm)染料遷移距離(cm)3) 標準曲線的制作：以各標準蛋白質相對遷移率為橫坐標，蛋白質分子量的對數為 縱坐標在半對數坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。4) 測定蛋白質樣品的分子量：根據待測蛋白質樣品的相對遷移率，從標準曲線上查得該蛋白質的分子量。五、思考題1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳的

29、幾個不連續性是什么？2. 電泳時的三個物理效應是什么？是怎樣造成的？3. 電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？4. 上樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？5. 貯液配制及貯存應注意什么？6. 過硫酸銨、7%乙酸和考馬斯亮藍在實驗中有什么作用？實驗六：脲酶的動力學研究一、實驗目的了解酶動力學的研究的一般內容及方法。掌握脲酶的動力學研究的操作步驟。二、實驗原理本實驗以脲酶(Mrease)為例研究底物濃度、pH、抑制劑(磷酸根離子)濃度對反應速度的影響，并學會計算Km、V 等常數。脲酶廣泛分布于植物界的種子中，某些微生物中也有，但在刀豆和大豆中含量較豐富。脲酶特異性地促使脲水解釋放出氨和二氧化碳

30、，其反應如下：脲酶屬于一種寡聚酶44，分子量約為483000，等電點為4.8，最適pH 7.0。三、儀器和試劑1）儀器 細玻棒、恒溫水浴、恒溫箱、微量水平滴定管、吸量管。2）實驗原料：新鮮大豆粉3）試劑1. 30乙醇(VV) 2. 1/10mol/L 尿素:稱取0.6g尿素，加水至100 mL。然后稀釋至1/20 mol/L；1/30 mol/L；1/40 mol/L；1/50 mol/L備用。3. 1/15mol/L PH7.0磷酸鹽緩沖液：取60 mL 1/15mol/L磷酸氫二納和40 mL 1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液。4. 10ZnSO4溶液5. 0.5M氫氧化鈉溶液6. 10酒

31、石酸鉀鈉溶液7. 奈氏(Nessler)試劑: 5g 氯化汞溶于50mL 蒸餾水中；稱取6.2g 碘化鉀，溶于20mL 蒸餾水中，上述二者混勻，并不斷攪拌，再加入7.5 g 碘化鉀，直至產生紅色沉淀不再溶解時。再加20 mL 含15g氫氧化鈉溶液，稀釋至100mL，混勻，靜置過夜，傾出上清液貯存于棕色瓶中。四、操作步驟 取試管5支，按實驗表加入各試劑（mL）。管號試劑名稱123451/15mol/L PH7.0磷酸鹽緩沖液0.60.60.60.60.6尿素溶液0.2（1/20）0.2（1/30）0.2（1/40）0.2（1/50）0.2（1/50）尿酶液煮沸尿素溶液0.20.20.20.2-0

32、.237水浴下放置5min10ZnSO4溶液H2O0.5M氫氧化鈉溶液0.530.50.530.50.530.50.530.50.530.5將上述各管搖勻，靜置5分鐘，離心，取上清。另取試管5支，按實驗表加入各試劑（mL）。管號試劑名稱12345上清液H2O10酒石酸鉀鈉溶液奈氏劑OD420240.51240.51240.51240.51240.51迅速混勻，以第5管為對照，測OD420值。(五) 結果處理 作圖計算該實驗條件下脲酶的Km值。實驗七： 用正交法測定幾種因素對酶活性的影響一、實驗目的初步掌握正交法(正交試驗設計法)的使用。運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH 值這四種因素對

33、酶活力的影響。二、實驗原理酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變化條件下的酶活力測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試驗設計法(簡稱正交法)來完成。正交法是借助于正交表，簡化表格計算，正確分析結果找到實驗的最佳條件、分清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數達到好的實驗效果。 本實驗運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH 值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH 值時酶的活力最大。三、儀

34、器、原料和試劑1）儀器 試管及試管架、恒溫水浴箱、小漏斗及濾紙、分光光度計、吸量管、小漏斗及濾紙、 pH 計。2）原料 牛血清白蛋白、牛胰蛋白藥。3）試劑1. 牛血清白蛋白：20mL 蒸餾水中加入牛血清白蛋白2.2g，尿素36g，1mol/LNaOH 溶液8mL，室溫放置1h，使蛋白質變性。如有不溶物，可過濾除去。再加0.2 mol/LNaH2PO4溶液至110mL 及尿素4g，調節溶液pH 達7.6左右。2. 蛋白酶液：3mg 牛胰蛋白酶冷凍干粉，溶于10mL 蒸餾水。3. 15三氯乙酸溶液：15g 三氯乙酸溶于蒸餾水并稀釋至100mL。4. l mol/LpH 7、8、9巴比妥緩沖液5.

35、Fo1in-酚甲試劑 4碳酸鈉溶液； 02氫氧化鈉溶液； 1硫酸銅溶液； 2酒石酸鉀鈉溶液 臨用前將與等體積配制碳酸鈉氫氧化鈉溶液。與等體積配制成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后把這兩種試劑按50：1的比例混勻。即成Folin酚甲試劑。此試劑臨用而配制，一天內有效。6. Folin酚乙試劑 7. 0.1mol/LNaH 2PO4溶液 8. 尿素 9. 1mol/LNaOH 溶液四、操作步驟(一) 實驗設計1. 確定試驗因素和水平 本實驗取四個因素，即底物濃度S、酶濃度E、溫度、pH 值。每個因素選三個水平(水平即在因素的允許變化范圍內，要進行試驗的”點”)。試驗因素和選用水平如下表所示。作因素、水平

36、表時，各因素的水平最好不要按大小順序排列。按一般方法，如對四個因素三個水平的各種搭配都要考慮，共需做34×81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。2.選擇合適的正交表合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應該不大于所選正交表的總自由度。正交表Ln(tq)L正交表的代號；n處理數(試驗次數)；t 水平數；q因素數。(二) 實驗安排1. 試驗安排設計各管均加人15三氯乙酸溶液2mL 終止反應。另取試管一支作非酶對照，即加2血紅蛋白液0.5mL，緩沖液2.0mL。先加15三氯乙酸溶液2mL，搖勻放置10min 后再加入酶液0.5mL。將上述酶促和非酶對照各管反應液室溫放置15min，過

37、濾濾液保留，用于測定酶活力。酶活力測定：取濾液0.5mL，加入Folin酚甲試劑4mL，混勻室溫放置10min，再加Fo1in酚乙試劑0.5mL，迅速混勻，于30保溫30min 后，在680nm 處測光吸收值。管號試劑名稱2 4 91 6 83 5 72血紅蛋白0.5 0.2 0.80.5 0.2 0.80.5 0.2 0.8緩沖溶液pH9 pH8 pH72 2 237預熱5分鐘pH7 pH9 pH82 2 250預熱5分鐘pH8 pH7 pH92 2 260預熱5分鐘酶液0.5 0.8 0.2 37反應10分鐘0.8 0.2 0.550反應10分鐘0.2 0.5 0.860反應10分鐘(三)

38、 試驗結果及分析實驗做好后，把9個數據填入下表試驗結果欄內，按表中數據計算出各因素的一水平試驗結果總和、二水平試驗結果總和、三水平試驗結果總和，再取平均值(各自被3除)。最后計算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出哪個因素對酶活力影響最大，哪個影響最小，找出在什么條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結論。以A 值/3，/3，/3為縱坐標，因素的水平數為橫坐標作圖。實驗因素實驗號1 2 3 4 實驗結果S/mL E /mL 溫度/ pH A680123456789（一水平試驗結果總和）（一水平試驗結果總和）（一水平試驗結果總和）/3/3/3極差1 0.5 1 0.8 1

39、 50 1 71 0.5 2 0.5 2 37 2 91 0.5 3 0.2 3 60 3 82 0.2 1 0.8 2 37 3 82 0.2 2 0.5 3 60 1 72 0.2 3 0.2 1 50 2 93 0.8 1 0.8 3 60 2 93 0.8 2 0.5 1 50 3 83 0.8 3 0.2 2 37 1 7五 思考題 正交法與一般方法比較有何優點？實驗八： DNA的提取與測定一、實驗目的學習DNA的提取方法；掌握紫外吸收法檢測DNA濃度和純度的原理和方法。二、實驗原理 DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子

40、則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度，OD值為1相當于大約50g/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H2O為空白對照，根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數×稀釋倍數/1000。RNA（mg/ml）=40×OD260讀數×稀釋倍數/1000。DNA/RNA純品的OD260/OD280為1.8或2.0，故根據OD260/OD280的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘余蛋白質存在。OD230/OD2

41、60的比值應在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在.本實驗室機器顯示是OD260OD230，則比值應在2-2.5之間，偏小則說明有殘余鹽剩余。三、試劑1）DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1SDS，2）3M NaAc3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA4）酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)5）氯仿:異戊醇(24:1)6) 異丙醇； 無水乙醇 ； 75%乙醇； RNase A四、實驗步驟（一）DNA的提取1. 取真菌菌絲（或動物細胞）0.5g, 在液氮中迅

42、速研磨成粉。2. 加入4mL提取液，快速振蕩混勻。3. 加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋35min（此處是粗提沒有加酚，可以節約成本的喲！）4. 1000rpm，4，5min。5. 上清用體積的氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4離心5 min）。6. 取上清，加入2/3倍體積的-20預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min。7. 用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ulTE中。8. 加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37處理1 hr。9. 用酚（

43、pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4離心5 min）。10. 取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70沉淀30 min以上。11. 沉淀用75%乙醇漂洗，風干, 溶于200 ulTE中，-20 保存備用。(二) DNA的定量與純度的測定1. 將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中pH8.O, 1Ommo1/L的Tris緩沖液,內含1mmol/L EDTA或懸浮溶解在滅菌水中(依據DNA含量加水)。2. 用可掃描的紫外分光光度計測定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線，測定OD260和OD280，并計算

44、比值：OD260/OD280，純DNA的此比值約為1.82.0。純RNA的此比值約為大于2.0。3. 根據：每毫升1微克的純DNA的OD260值= 0.020，計算所得DNA的純度；每毫升1微克的純RNA的OD260值= 0.025，計算所得RNA的純度；并討論純度較低的原因和解決辦法。260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，只看OD260/OD280。DNA:  OD260/OD280比值應接近1.80，若大于1.8。說明存在RNA，可重新用RNaseA處理,酚:氯仿:異戊醇(23:24:1)抽提。若小于1.

45、8，則說明有蛋白質等雜質存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、異戊醇重新對DNA進行純化（也可加入1/8體積的3M NaAc(pH5.2)與冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。注意事項： 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。五、思考題1核酸分離時為什么要除去小分子物質和脂類物質？本實驗是怎樣除掉的？2運用本實驗方法是否可以提取到能夠進行其他生物實驗用的核酸材料?實驗九： 瓊脂糖凝膠電泳實驗一、實驗目的學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；掌握使用水平式電泳儀的方法；學習在含有甲醛的凝膠上進行RNA電泳的方法。二、實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規方法。核酸是兩性電解

46、質，其等電點為pH2-2.5，在常規的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。（2）DNA分子的構象。當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋質粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而

47、開環狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。（4）離子強度影響。電泳緩沖液

48、的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以現在也開發出了安全的染料，如Sybergreen。常規的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但

49、經甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發生高效雜交。三、試劑與器材1) 材料電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等2）試劑1、50×TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。2、GoldView DNA染料。3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。四、操作方法（一）常規的水平

50、式瓊脂糖電泳制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表： 瓊脂糖的含量（%） 分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb） 0.3 60-5 0.6 20-10.7 10-0.80.9 7-0.51.2 6-0.41.5 4-0.22.0 3-0.11制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。2膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50

51、左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；3加樣：點樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。4電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正

52、比，最高電壓不超過5V/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。5觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統中拍照并保存之。實驗十：還原糖和總糖的測定（3，5-二硝基水楊酸法）一、實驗目的了解3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的基本實驗。區分還原糖和總糖測定過程的異同，掌握具體的、操作方法。二、實驗原理還原糖是指含有自由基醛基或酮基、具有還原性的糖類。單糖都是還原糖。3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后可生成棕紅色氨基化合物。在一定范圍內，該棕紅色化合物顏色的深淺與還原糖的量呈正比關系，可用分光光度計進行比色測定。因此3，5-二硝基水楊酸法可用于還原糖的測定，且具有快速、雜質干擾小的優點。不具還原性的部分雙糖或多糖經酸水解后可徹底分解為具有還原性的單糖。通過對樣品中的總糖進行酸水解，測定水解后還原糖含量，可計算出樣品的總糖含量。三、儀器、原料和試劑（1）儀器：電熱恒溫水浴鍋、分光光度計、試管及試管架、玻璃漏斗、容量瓶(100mL)、量筒（10mL，100