1、MTT 原理、步驟、結果分析方法及注意事項MTT 原理MTT 全稱為 3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-（4 ,5-二甲基壤哇-2）-2 , 5-二苯基四氮哇漠鹽，商品名：壤哇藍。是一種黃顏色的染料。MTT 比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞硯（DMSO 能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm 波長處測定其光吸收值，可

2、間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT 結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗 腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確 性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的 MTT 濃度為 5mg/ml。因此，可以稱取 MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷酸緩沖液（PB0 或無酚紅的培養基中，用 0.22 卬 m 濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放 4C 避光

3、保存即可。在配制和保存的 過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT 法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果 的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在 0-0.7 范圍內。MTT 一般最好現用現配，過濾后4oC 避光保存兩周內有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT 粉分裝在 EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當 MTT 變為灰綠色時就絕對不

4、能再 用了。MT1W 致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的 MTT 需要無菌，MTT 對菌很敏感；往 96 孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制 MTTM 用 PBS （ph=7.4 ）溶解。PBS 配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g+ Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g調 pH 7.4,定容 1Lo普通 MTT 法實驗步驟：1:接種細胞： 用含 10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液， 以每孔 1000-10000 個細胞接種到 96 孔 板， 每孔體積 200ul.2:培養細胞：同

5、一般培養條件，培養 3-5 天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。3:呈色：培養 3-5 天后，每孔加 MTT 溶液（5mg/ml 用 PBS 配制，pH=7.4）20ul.繼續孵育 4 h,終止培養， 小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMS 批蕩 10min,使結晶物充分融解。4：比色：選擇 490nm 波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值 為縱坐標繪制細胞生長曲線。藥物 MTT 法實驗步驟貼壁細胞：1:收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000- 100

6、00 孑 L,（邊緣孔用無菌 PBS 填充）。2: 5%CO2 37C 孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即 可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板， 次日上午加藥.一般 5-7 個梯度，每孔 100ul, 設 3-5 個復孔.建議設 5個，否則難以反應真實情況3: 5%CO2, 37C 孵育 16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。4:每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml,即 0.5%MTT ,繼續培養 4h。若藥物與 MTT 能夠反應，可先離心后棄 去培養液，小心用PBS 沖 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培養液。5:

7、終止培養，小心吸去孔內培養液。6:每孔加入 150ul 二甲基亞硯，置搖床上低速振蕩 10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 OD490nm 處測量各孔的吸光值。7:同時設置調零孔（培養基、 MTT 二甲基亞硯），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、 MTT 二甲基亞硯）。懸浮細胞：1:收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度 1X 106/ml，按次序將補足的 1640 （無血清）培養基 40ul : 加 ActinomycinD（有毒性）10ul 用培養液稀釋（儲存液 100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20）;需檢測物 10ul ;細胞懸液 50ul （即 5

8、X 104cell/孑 L）,共 100ul 加入到 96 孔板（邊緣孔用無菌水填 充）。每板設對照（加 100ml 1640 ）2:置 37C, 5%CO 瓣育 16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。3:每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT ,繼續培養 4 h。（懸浮細胞推薦使用 WST-1,培養4 h 后可跳過步驟 4）,直接酶聯免疫檢測儀 OD570nm（630nm 校準）測量各孔的吸光值）4、 離心（1000 轉 x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul 二甲基亞硯，置搖床上低速振蕩10 min ,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570n

9、m（630nm 校準）測量各孔的吸光值。5、 同時設置調零孔（培養基、MTT 二甲基亞硯），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、 MTT 二甲基亞硯），每組設定 3 復孔。注意事項：（1） 選擇適當得細胞接種濃度。（2） 避免血清干擾：一般選小于 10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。（3） 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白 調零。（4） MTT 實驗吸光度最后要在 0-0.7 之間，超出這個范圍就不是直線關系。（5） 用 96 孔板培養細胞做 MTT細胞活力，應該加多少 1640 培養基，多少 MT

10、 畫 DMSO適根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSQ 前要盡量去掉培養液，便于DMS 笄解甲月贊顆粒進行比色測定（6）一般每孔 4000 個細胞為宜，既細胞濃度在20000 個/ml , MTT 加20ul ,作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓚洗掉，然后每孔加150ul DMSO,在脫色搖床上振蕩 10 分鐘，然后測吸光值。轉-MTTW原理、步驟以及注點事項MTT理MT代稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide,漢語化學名為3-（4 , 5-二甲基喋口坐

11、-2）-2 , 5-二苯基 四氮哇漠鹽，商品名：喋哇藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中 的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基業碉（DMSO能溶解細胞中的甲瓚， 用酶聯免疫檢測儀在490n堿長處（也有用570n堿長的，我目前用的都是570nm）測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT吉晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞蠹性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏

12、 度高、經濟。缺點：由于MTTg還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。 這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響， 而且溶解甲的有機溶 劑對實驗者也有損害。MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS或無酚紅的培養基中，用0.22 m濾膜過濾以除去溶液里 的細菌，放4C避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包 住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕 對數。在用酶標儀檢測結果的時候

13、，為了保證實驗結果的線性，MTT吸光度最好 在0-0.7范圍內。MT股最好現用現配，過濾后4C避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存 在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔 紙包住避光以免分解。我一般都把MT砒分裝在EP管里，用的時候現配，直接 往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MT攻為灰綠色時就絕對不能再 用了。我自己操作一般是每次配制15ml，過濾后4C避光保存，在兩周內用完。MTK致癌性， 用的時候小心， 有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTTB要無菌，MTTX菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短， 或者你不放心的時

14、候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用PBS（ ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + NazHPO 1.44g+ KH2PO 0.24g調pH 7.4,定容1L。普通MTT法實驗步驟：1:接種細胞：用含10%胎小牛血活得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養 時間）。3:呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul.繼續孵育4 h ,終止培養， 小心吸棄孔內培養上活液， 對丁懸浮細胞需

15、要離心后再吸棄孔內培養 上清液。每孔加150ul DMSQ脫色搖床振蕩10min,使結晶物充分融解。4:比色：選擇490nm（570nn）波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值， 記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。藥物MTT法實驗步驟貼壁細胞：（我的主要操作是貼壁細胞）1:收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度1000-10000孑L,（邊緣孔用無菌PBS填充）。2: 5%CO, 37C孵育，至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后 即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥. 一般5-7個梯度

16、，每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情 況。3: 5%CO2 37C孵育24-72小時，倒置顯微鏡下觀察。4:每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT ,繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS?中2-3遍后，再加入含MTTB培養液。5:終止培養，小心吸去孔內培養液。6:每孔加入150ul二甲基業碉，置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。 在酶聯免疫檢測儀OD490nm570nm壯測量各孔的吸光值。7:同時設置調零孔即空白組（培養基、MTT二甲基業碉）,對照孔（細胞、相 同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT二甲

17、基業碉）。懸浮細胞：1:收集對數期細胞，調節細胞懸:液濃度ix 106/ml，按次序將補足的1640（無 血活）培養基40ul;加Actinomycin D（有蠹性）10ul用培養液稀釋（儲存 液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20）;需檢測物10ul ;細胞 懸液50ul（即5X 104cell/孑L） ,共100ul加入到96孔板 （邊緣孔用無菌水填 充） 。 每板設對照 （加100ml 1640）。2:置37C, 5%CO2孚育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3:每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml ,即0.5%MTT，繼續培養4 h。（懸:浮 細胞推薦

18、使用WST-1培養4 h后可跳過步驟4）,直接酶聯免疫檢測儀OD570nm （630nm校準）測量各孔的吸光值）4、 離心（1000轉x10min）,小心吸掉上活，每孔加入100 ul二甲基業碉，置 搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm630nm校準）測量各孔的吸光值。5、 同時設置調零孔（培養基、MTT二甲基業碉）,對照孔（細胞、相同濃度的 藥物溶解介質、培養液、MTT二甲基業碉），每組設定3復孔。注意事項：（1）選擇適當得細胞接種濃度。每孔1000-10000個，但是也要看細胞種類和狀態。我做的是藥物抑制腫瘤細胞生長和增殖，鋪過2000至8000個每孔。2000太低，8000過高，對丁陰性組高丁5000個吸光值就很大，大丁1.5。所以對丁 我自己的A549實驗一般選用3000-5000。一般每孔4000個細胞為宜（2）避免血活干擾：一般選小丁10%的胎牛血活的培養液進行試驗。在呈色后 盡量吸盡孔內殘余培養液。（3）設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟 保持一致，最后比色以空白調零。（4）MTT實