1、功能基因組學的研究方法基因組學(genomics),研究生物基因組和如何利用基因的一門學問。它的 研究包括兩方面的內容：以全基因組測序為目標的結構基因組學( structural genomics)和以功能鑒定為目標的功能基因組學(functional genomics)。隨著 測序的完成，功能基因組學成為研究的熱門。由于本人的SRT®目是做關于水稻 突變方面的，故本文將圍繞功能基因組學的研究方法及水稻突變體展開。功能基因組學，往往又被稱為后基因組學(postgenome)。它是利用結構基 因組學提供的信息和產物，力圖從基因組和系統水平上全面分析基因的功能。目 前，大規模、高通量分析

2、基因功能主要借助表達序列標簽、cDNA微陣列和DNA芯片、蛋白質組學、生物信息學以及反向遺傳學等方法來實現：1表達序列標簽(EST)表達序列標簽(Expfessed Sequence Tag , EST)是指從不同組織來源的cDNA 文庫中隨機挑取克隆，對其進行大規模測序所獲得的部分cDNA勺5'或3'端序列。 一個EST對應于某一種 mRNA勺cDNA隆的一段序列，長度一般為300500bp。 建立這些序列的數據庫即為EST文庫。將測序所得到的ESTs與dbEST等數據庫 中的數據進行相似性分析，根據核酸或蛋白質序列的同源性比較，即可鑒定出哪 些EST代表已知基因，哪些EST

3、代表未知基因，并對所得各基因的EST進行基因 表達情況和表達豐度分析。這也是近幾年來分離與克隆新基因及基因功能研究的 一個行之有效的手段。2 cDNA微陣歹U和DNAE片cDNA微陣歹U (cDNA micro-array) 和 DNA芯片(DNA chip)都是基于 Revese Northern雜交以檢測基因表達差異的技術。二者的基本原理是利用光導化學合 成，照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相支持物上固定成千上萬個cDNA EST或基因特異的寡核甘酸探針，并與放射性同位素或熒光標記的靶 DNAa行雜交，然后用相應的檢測系統進行檢測。根據雜交信號強弱及探針的位 置和序列，即可確定

4、靶DNA勺表達情況以及突變和多態性的存在。3蛋白質組學(Proteomics)蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內動態變化的蛋白質組成成 分、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，在整體水平上研究蛋白質的組成與調控活動規律的一門新興學科。基因是遺傳信息的攜帶者，而生命活動的執行者卻是蛋白質，即基因表達產物。因此對基因功能的研究就離不 開對蛋白質功能的研究。隨著后基因組學時代的到來，對蛋白質功能的研究必將 會從對特定蛋白質的研究上升到對生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式的 研究，即蛋白質組學的研究。4 生物信息學(Bioinformatics )生物信息學是將分子生物學和

5、數學、計算機信息處理技術相結合，用數理和 信息科學的觀點、理論和方法研究生命現象、組織和分析呈指數增長的生物學數 據的一門新興學科，即以DNAF口蛋白質為研究對象，以計算機為主要工具，發展 各種軟件，對日益增長的海量的DNAF口蛋白質的序列結構進行收集、整理、儲存、 加工、分析和研究，目的是通過這樣的分析認識生命的起源、進化、遺傳和發育 的本質，破譯隱藏在DNAff列中的生物信息。它由數據庫、計算機網絡和應用軟 件三大部分組成。5 反向遺傳學(Reverse genetics)傳統的遺傳學或稱為正向遺傳學，主要研究自發或誘變突變體中某一突變形 狀的遺傳行為，如控制突變形狀的基因的數目及其在染色

6、體上的位置、突變體性狀在后代中的傳遞規律等。而反向遺傳學是相對正向遺傳學而言的， 是在基因功 能序列已知的基礎上分析基因研究基因功能，一般通過創造功能喪失突變體來研 究突變體所造成的表型效應，并推測在生物體內基因的作用。各種方法各有優缺點，往往結合使用能很好的分析基因組，取得很好的結果。了解了分析基因組的方法，我們還要有好的材料才能有效地研究水稻。突變 體是某個性狀發生可遺傳變異的材料，或某個基因發生突變的材料。長期以來， 水稻育種家盡力地發現和分離有價值的自然突變和變異材料。突變的本質就是 DN再列的改變，包括單個堿基或大的片段發生突變、插入、缺失或結構重排， 從而導致遺傳信息的改變。突變的

7、目前，水稻突變體的創制常有以下方法：1自發突變自發突變即在自然環境下發生的遺傳信息的變異或突變，但突變率低，一般少于。水稻的單英突變體 mocl就屬于自發突變。2物理、化學誘變用物理、化學方法可快速獲得較廣的突變譜及穩定的遺傳變異，可導致多位 點的變異，比較容易得到飽和突變體庫 ，且具隨機突變優點，突變率可達3%左 右。物理方法主要應用輻射產生水稻突變體，電離輻射主要是X射線、y射線、紫外線、a粒子及？粒子、質子及中子等。一般水稻大部分以處理干種子為主， 也可處理幼穗分化的植株。化學誘變劑的種類很多，可分為4類：（1）堿基類似物及有關的化合物，5-澳-尿喀呢、5-澳去氧尿核甘、2-氨基-喋吟和

8、8-乙氧基 咖啡堿；（2）抗生素，重氮絲氨酸、絲裂霉素 C和鏈霉黑素；（3）烷化劑，甲基磺 酸乙酯、甲基-N-亞硝基月尿烯亞胺、亞硝基乙基尿烷和亞硝基乙基尿；（4）其他種 類的誘變劑，亞硝酸和口丫呢。3 插入突變法插入突變法主要包括T-DNA插入法和轉座子法。T-DNAB入法：T-DNA來自根癌農桿菌Ti質粒，約20 kb,包含專化冠 嚶堿生物合成和冠嚶瘤生長的基因，隨機地整合到植物染色體上。自 Hiei等 （1994）首次報道用農桿菌介導法對水稻成功地實現遺傳轉化以來， 該方法在水稻 遺傳轉化中得到廣泛應用并不斷完善,并被廣泛應用于水稻 T-DNA雨入突變體 庫的構建。轉座子法：轉座子（tr

9、ansposon）是染色體上一段可移動的 DNAfr段，它可從 染色體的一個位置跳到另一個位置。 當轉座子跳躍而插入到某個功能基因時， 就 會引起該基因的失活，并誘導產生突變型，而當轉座子再次轉座或切離這一位點 時，失活基因的功能又可得到恢復。遺傳分析可確定某基因的突變是否由轉座子 引起。用轉座子引起的突變的轉座子 DNM探針，從突變株的基因組文庫中釣出 含該轉座子的DNAt段，并獲得含有部分突變株 DNAff列的克隆，進而以該 DNA 為探針，篩選野生型的基因組文庫，最終得到完整的基因。不同的研究方法利用了不同的突變機制，突變的本質就是 DNAff列的改變, 包括單個堿基或大的片段發生突變、

10、插入、缺失或結構重排，從而導致遺傳信息 的改變。突變的機制主要有以下幾種：1直接作用于DNA真板亞硝酸和烷化劑等化學誘變劑可直接作用于 DNA改變模板的性質或干擾復 制，使錯誤的堿基插入而產生突變。如最常用的EM訛學誘變所導致的DN校變2堿基類似物誘變DN&S制時滲透入并且與互補鏈上的堿基生成氫鍵而配對，從而抵抗DN服的3'外切核酸酶活性的校對功能,如5 一澳一尿喀呢、5 一澳去氧尿核甘、2 一 氨基一喋吟、8-乙氧基咖啡堿所導致的DN岐變。3移碼突變口丫噬橙、原黃素和口丫黃素等口丫噬類染料分子均含有口丫噬稠環。 這種三環分子 的大小與DNA勺堿基對大小差不多，可以嵌合到DNA勺堿基對之間，于是原來相 鄰的兩個堿基對分開一定的距離， 含有這種染料分子的DNAE復制時，由于某種 目前尚不知曉的原因，可以插入一個堿基，偶爾也有兩個。這樣就出現一個或幾 個堿基對的插入突變。有時也有很低頻率的單堿基缺失突變。 所有這些突變，都 引起閱讀框的改變。4轉座成分的致突變作用生物體內含有許多轉座成分，它們一般長數百至數千 bp,可以通過一種復 雜的轉座機制將其一個復制拷貝插入到基因組的另一個位點。 如果這個位點處于 一個基因內部，這種大片段的插入常常造成基因失活。5紫外線等的致突變作用紫外線照射DNA由于高能粒子的直接作用和自由基的