1、質粒dna的提取和鑒定質粒(plasmid)v是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）和細菌細胞中染色體以外的DNA分子，在基因工程中質粒常被用做基因的載體。 是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）和細菌細胞中染色體以外的DNA分子，在基因工程中質粒常被用做基因的載體。分離質粒DNA的 基本步驟v培養細菌使質粒擴增；v收集和裂解細菌；v分離和純化質粒DNA 質粒DNA的提取方法v堿變性法（堿裂解法）；v煮沸裂解法；v羥基磷灰石柱層析法；v質粒DNA釋放法；v酸酚法等。 堿變性（裂解）法基本原理： 在堿性條件下

2、（pH 12.6），染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性，質粒DNA氫鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH 4.8的乙酸鈉將其pH調到中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，而染色體DNA不能復性，形成纏繞的致密網狀結構，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。原理示意圖質粒DNA電泳電場中DNA分子的遷移速度取決于：vDNA分子本身的大小vDNA分子的空間構型超螺旋構型（ccDNA)線形DNA(lDNA)開鏈環狀DNA(ocDNA)復制中間體（沒有復制完的兩個質粒連在一起)

3、溴化乙錠（EB）是一種熒光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，其分子可以嵌入到核酸的堿基對之間，在紫外線的激發下，發出橙色熒光 Attention, please!vEB是強誘變劑，配制和使用EB染色液時，應帶乳膠手套或一次性手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必須進行清洗或棄去！質粒提取實驗材料與試劑 v實驗材料：實驗材料：過夜培養大腸桿菌DH-5av實驗試劑：實驗試劑：LB培養基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、瓊脂糖 TE：10mM Tris.CL （

4、pH8.0），1mM EDTA溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鮮配制）v溶液溶液溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。v溶液溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。v溶液溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。步驟一 細菌培養與質粒擴增 1. 挑單克隆E.coli菌株接種到4ml LB培養液中（含Amp 50g/ml），37 225rpm振蕩培養過夜。（活化菌種） 2.從中取2ml種子菌液于含Amp培

5、養基500ml中，37振蕩培養3-4小時（OD6001.0） 3.取4ml培養液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 離心30秒，棄上清，用1ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復一次，棄上清，取沉淀。 步驟二 質粒提取取4ml培養物至Eppendorf管中，12000rpm，4，離心30sec，棄上清。用1ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復一次，棄上清取沉淀，使細胞沉淀盡可能干燥。將細菌沉淀懸浮于100l預冷的溶液I中，加入10 l溶菌酶（10mg/ml），劇烈振蕩均勻，冰上放置1分鐘。加200L溶液II（新鮮配制），蓋緊Eppendorf管，快速輕柔顛倒5次，混

6、勻內容物，將Eppendorf管放在冰上3分鐘 。5.加入150L溶液III （冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 離心5min，將上清夜轉至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等體積酚/氯仿（1：1），振蕩混勻，室溫放置5-10min，12000 rpm，4 下離心2分鐘，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 8.加入2倍體積冰預冷無水乙醇，振蕩混勻，12000 rpm 4 離心5分鐘。9. 倒去上清，加入1ml冰預冷70%乙醇振蕩漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 離心2分鐘。10棄上清并盡量吸除液體，

7、打開管蓋，室溫放置5min。室溫放置15min干燥。1150l TE緩沖液(含無DNase的RNase 20 g/ml)，使DNA完全溶解（-20保存）12取樣品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %瓊脂糖電泳，電泳凝膠在凝膠成像系統上成像。 M pBSK pGFP菌體老化菌體老化堿裂解不充分堿裂解不充分菌體中無質粒菌體中無質粒溶液使用不當溶液使用不當請涂布平板培養后，重新挑請涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養選新菌落進行液體培養可減少菌體用量或增加溶液可減少菌體用量或增加溶液的用量的用量不要頻繁轉接，每次接種時不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。檢查抗生素應接種

8、單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。使用濃度是否正確。溶液溶液在溫度較低時可能出在溫度較低時可能出現渾濁，置于現渾濁，置于3737保溫片刻保溫片刻直至溶解為清亮的溶液直至溶解為清亮的溶液。q問題一：未提出質?；蛸|粒得率較低，如何解決？問題一：未提出質?；蛸|粒得率較低，如何解決？ 原原因因對對策策質粒DNA提取常見問題混有蛋白混有蛋白混有混有RNARNA混有基因組混有基因組DNADNA不要使用過多菌體。重新純化不要使用過多菌體。重新純化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等雜質等雜質加入加入RNaseARNaseA室溫放置一段時間室溫放置一段時間加入溶液加入溶液II II 和

9、和IIIIII后后防止劇烈振蕩防止劇烈振蕩，可能把基因組，可能把基因組DNADNA剪切成碎剪切成碎片從而混雜在質粒中。細菌培片從而混雜在質粒中。細菌培養時間過長會導致細胞和養時間過長會導致細胞和DNADNA的降解，培養時間不要超過的降解，培養時間不要超過1616小時。小時。質粒DNA提取常見問題q問題二：質粒純度不高，如何解決？問題二：質粒純度不高，如何解決？ 原原因因對對策策提高質粒產量的注意事項 v加入溶液I 后，渦旋振蕩應充分打散菌體使之均勻懸浮；v加溶液II裂解要完全(快速輕柔顛倒5-10次) ，使蛋白質和核酸變性；v加溶液III后PH要達到中性(輕柔振蕩5-10次 )，使質粒DNA復

10、性，這樣才能使質粒DNA與染色體DNA完全分開，否則，難分開，所以裂解和復性這兩步要從嚴掌握。v加入乙醇沉淀DNA時，要把離心管蓋上蓋子倒翻搖動幾次，注意觀察水相和乙醇之間沒有分層現象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 DNA的限制性酶切Plasmid (質粒)vPlasmid mapvPolylinkervSequence mapvRestriction enzyme mapPolylinker (多克隆位點）Sequence Map GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAG

11、TATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGAC

12、GTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG

13、GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATA

14、TCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG

15、GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGT

16、TTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGC

17、AGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAG

18、ATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCRestriction mapv限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶: :一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。限制性切酶以內切的方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5端帶磷酸基團，3端為-OH。限制性核酸內切酶分類v識別切割特性v催化條件v是否具有修飾酶活性v至2005年1月，共發現限制酶3681種 型59種 型3612種 型10種v商業化的限制酶有 588 種，在 型限制酶中共有 221 種

19、特異性。EcoRI型限制與修飾系統v占90%以上，即通常指的DNA限制性內切酶，它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內進行切割，產生特異的DNA片段；v型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為4-6個堿基對的反轉重復順序；v型內切酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。 酶切反應中應注意以下幾個問題： 1. 內切酶：內切酶：不應混有其他雜蛋白特別是其他內切酶或外切酶的污染；注意內切酶的識別位點和形成的粘性末端；2. 內切酶的用量：內切酶的用量：根據內切酶的單位和DNA用量而定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶進行酶切為宜；3. 內

20、切酶體積：內切酶體積：不能超過反應體系的10%，因內切酶中含50%甘油，體系中甘油超過5%會抑制內切酶的活力；4. 操作條件：操作條件：反應體系配置應在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內切酶的污染。5. DNA：作為內切酶的底物，DNA應該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，這些因素的存在均在不同程度影響限制性內切酶的活性。 反應緩沖液：1. 反應緩沖液反應緩沖液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+ 為內切酶的輔基；A. Tris-HCl維持反應體系的PH值在7.27.6之間；B. NaCl濃度： 低鹽(10mM NaCl) 中鹽(5

21、0mM NaCl) 高鹽(100mM NaCl)2. 酶解的溫度酶解的溫度：大多數限制酶的反應時間為37，如EcoR、Hind、BamH、Pst等，也有如Bcl需在50下進行反應。3. 酶解反應時間酶解反應時間：根據酶的單位與DNA用量之比來定，原則是酶/DNA23，12小時即可充分酶解。4. 酶單位定義酶單位定義：在每種內切酶理想的反應條件下 ， 0.05mL反應混合物中, 1小時消化1g底物DNA的酶量為1單位(1U)。雙酶切實驗材料v限制性內切酶：EcoR、Xba和HindvDNA：DNA和質粒pCDNA-p38v10buffer H （37, PH7.5） 90mM TrisCl 50

22、mM NaCl 10M MgCl2v10buffer M（37, PH7.5） 6mM TrisCl 100mM NaCl 6M MgCl2v1mM DTTv10BSA： 1mg/mlv無菌水方法和步驟1. 1. 反應體系配制：反應體系配制：質粒pCDNA3p38 10 l（1g） 10buffer M 2 l 10BSA 2 l EcoR 1 l Xba 1 l H2O 4 l 總體積 20 l2. 將反應體系充分混勻，并于臺式離心機上短暫離心收集液體。3. Eppendorf管于37水浴中反應1.5小時。4. 反應結束后70滅活15min或者加入EDTA至終濃度10mM終止反應。5. 取20l反應液加入6loading buffer混勻于1.2瓊脂糖凝膠膠上150伏電泳，約30min。 加入5l未酶切對照。6. 凝膠成像體系觀察記錄結果。7.當DNA條帶充分