1、 報告人：張煜 導師：唐瑜教授配位化學在細胞凋亡中的應用配位化學在細胞凋亡中的應用一、細胞凋亡的簡介一、細胞凋亡的簡介二、文獻二、文獻三、設計思路三、設計思路四、總結四、總結配位化學在細胞凋亡中的應用配位化學在細胞凋亡中的應用TextTextText一、細胞凋亡的簡介一、細胞凋亡的簡介19721972年年KerrKerr根據細胞發生與壞死不同的死亡現象，提出了細胞凋亡的概念，稱為根據細胞發生與壞死不同的死亡現象，提出了細胞凋亡的概念，稱為ApoptosisApoptosis，宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。而細胞程序性死亡（宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。而細胞程序性死亡（programm

2、ed cell deathprogrammed cell death，PCDPCD）最）最初是初是19561956年發育生物學中提出的概念，是個功能性概念，強調的是其分子生物學和生理功能，年發育生物學中提出的概念，是個功能性概念，強調的是其分子生物學和生理功能，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發育中的一個預定的、一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發育中的一個預定的、并受到嚴格程序控制的正常組成部分。在現在的研究中把二者作為一個意思解釋。隨著分子生并受到嚴格程序控制的正常組成部分。在現在的研究中把二者作為一個意思解釋。隨著分子生物學檢

3、測技術的飛速發展，近二三十年來，細胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來越受到醫物學檢測技術的飛速發展，近二三十年來，細胞凋亡的研究取得了重大的突破，越來越受到醫學界和生物學界的普遍關注。盡管人們尚未完全掌控細胞凋亡，但是目前人們對細胞凋亡機制學界和生物學界的普遍關注。盡管人們尚未完全掌控細胞凋亡，但是目前人們對細胞凋亡機制和凋亡異常導致的疾病有了比較全面的認識，并且根據細胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋和凋亡異常導致的疾病有了比較全面的認識，并且根據細胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋亡檢測方法。這些都為人們更加深入地研究細胞凋亡奠定了堅實的基礎，也為對疾病的新認識亡檢測方法。這些都為人們更加深入

4、地研究細胞凋亡奠定了堅實的基礎，也為對疾病的新認識打下了分子生物學基礎。而且也為解決惡性腫瘤的醫學難題指明了新的方向。打下了分子生物學基礎。而且也為解決惡性腫瘤的醫學難題指明了新的方向。凋亡細胞的特征凋亡細胞的特征welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience形態學特征形態學特征 細胞凋亡過程可分為三個不太明顯的階段：感應階段、效應階段和分解細胞凋亡過程可分為三個不太明顯的階段：感應階段、效應階段和分解階段。感應階段通過死亡誘導信號刺激凋亡前信號大量轉變。這種死亡誘階段。感應階

5、段通過死亡誘導信號刺激凋亡前信號大量轉變。這種死亡誘導信號包括氧化還原種類、神經酰胺信號、導信號包括氧化還原種類、神經酰胺信號、CaCa2+2+的超活化途徑和的超活化途徑和BclBcl家族家族蛋白如蛋白如BaxBax和和BadBad。在第二階段，即效應階段，在關鍵調節器。在第二階段，即效應階段，在關鍵調節器線粒體的線粒體的作用下，細胞開始死亡。最后的分解階段包含了細胞質和核質兩個部分。作用下，細胞開始死亡。最后的分解階段包含了細胞質和核質兩個部分。在細胞質中一種叫在細胞質中一種叫caspasescaspases的復合級聯蛋白被激活；在細胞核中，染色質的復合級聯蛋白被激活；在細胞核中，染色質濃縮

6、，核膜破裂濃縮，核膜破裂DNADNA被分解成若干小片段。最后細胞被分解成若干凋亡小被分解成若干小片段。最后細胞被分解成若干凋亡小體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識別后被鄰近的細胞或者吞噬細胞所吞噬。體，在表面的磷脂酰絲氨酸被識別后被鄰近的細胞或者吞噬細胞所吞噬。從細胞發生凋亡開始，到出現凋亡小體僅需數分鐘，而被吞噬消化整個過從細胞發生凋亡開始，到出現凋亡小體僅需數分鐘，而被吞噬消化整個過程可持續程可持續4 49 h9 h。凋亡細胞的特征凋亡細胞的特征welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years expe

7、rience生化特征生化特征 早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，對早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，對DNADNA染料碘化丙錠（染料碘化丙錠（PIPI）拒染，但）拒染，但可被另外一種可被另外一種DNADNA染料染料Hoechst 33342Hoechst 33342（Ho33342Ho33342）染色；而壞死細胞的胞）染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PIPI染色。凋亡細胞在凋亡早期原染色。凋亡細胞在凋亡早期原來位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（來位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PSPS）翻轉至磷脂雙分子層外側。凋亡）翻轉至磷脂雙分子層外側。凋亡

8、發生時線粒體呼吸鏈受損，使細胞生成發生時線粒體呼吸鏈受損，使細胞生成ATPATP的量減少；跨膜電位降低，細的量減少；跨膜電位降低，細胞色素胞色素c c從線粒體內漏到胞質中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中從線粒體內漏到胞質中；線粒體膜的通透性升高。胞漿中CaCa2+2+和和Mg2+Mg2+濃度升高，可以激活核酸內切酶和蛋白酶激活的核酸內切酶可以將濃度升高，可以激活核酸內切酶和蛋白酶激活的核酸內切酶可以將DNADNA切成切成5050300 bp300 bp大小的大小的DNADNA，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成寡聚核小體，形成1801802

9、00 bp200 bp的的DNADNA片斷。片斷。配位化學在細胞凋亡中的應用配位化學在細胞凋亡中的應用二、文獻報道二、文獻報道Conjugates of ferrocene with biological compounds. Coordination to gold complexes and antitumoral properties Journal of Inorganic Biochemistry 105 (2011) 13731382在這篇文獻中，他們合成了一系列帶有生物配體的二茂鐵配合物。并且將這些配合物和Au(I)和Au(III)結合。他們檢測了這兩個基團的結合位點。而且這兩個

10、基團結合表現出很好的抗癌活性。他們將金的配合物運用到三種癌細胞中：MCF-7（人類的乳腺癌細胞）、HeLa（人類的宮頸癌細胞）和NIE-115（來源于老鼠的交感神經囊腫神經元細胞）。檢測這些配合物對癌細胞的作用。Scheme 1. i) L-histidine methyl ester, ii) histamine, iii) L-tryptophan methyl ester, iv) L-methionine methyl ester, v) L-lysine ethyl ester , vi) L-prolinamide.第一步、合成所需的配合物第一步、合成所需的配合物Scheme 2.

11、 i) Au(acac)(PR3), ii) Au(acac)(PR3), iii) Au(OTf)(PR3), iv) Au(C6F5)3(OEt2).第二步、基于第二步、基于MTT比色法檢測比色法檢測IC50值的實驗值的實驗 Cells were exposed to each compound for a total of 48 h. Using the colorimetric mitochondrial function-based MTT viability assay, the IC50 values (final concentration0.5% DMSO) were cal

12、culated from dose-response curves obtained by nonlinear regression analysis. IC50 values are concentrations of drug required to inhibit tumor cell proliferation by 50%, compared to the control viability.As demonstrated by the IC50 for 48 h values listed in Table 4, the tested ferrocene bioconjugates

13、 do not show significant antiproliferative activity but the gold complexes appeared to be quite effective as cytotoxic agents against in vitro growth of various cancer cell lines.MTT比色法原理比色法原理MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚，并沉淀在細胞中，而死細胞無此功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚。用酶聯免疫檢

14、測儀在440nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。MTT結晶形成量與細胞數成正比。IC50值的簡介值的簡介 IC50是指被抑制一半時抑制劑的濃度，這里的反應可以是酶催化反應，抗原抗體反應等。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數之比等于50%時所對應的濃度，IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數值越低，當然也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。IC50 (48 h) of complexes against HeLa, MCF-7, and N1E-115 cells.IC50 (M)

15、CompoundsHeLaMCF-7N1E-11531000NTNT41000NTNT61000NTNT7321.8151.2272.28221.9451.7261.69281.6521.2542.310291.3322.5102.211181.4151.8291.713872.0882.2312.4Fig. 3. Variation of cell survival with the incubation time (complex 10).第三步、流式細胞記數法第三步、流式細胞記數法l Flow cytometry studies using double staining with Ho

16、echst 33342 and propidium iodide showed also a significative percentage of apoptotic cells after incubation of MCF-7 cells with increasing concentrations of compound 10 (10 and 50 M) for 3 and 24 h (Fig. 4 and Table 5).l The use of the molecular probe H2DCF-DA showed that incubation of MCF-7 cells w

17、ith compound 10 produced an increasing dose and time dependent amount of reactive oxygen species (ROS) (Fig. 5 and Table 6).Fig. 4. FCM of light scatter of apoptotic MCF-7 cells. Cells were incubated for 3 and 24 h with complex 10 at 10 and 50 M. a) 10 M for 3 h; b) 10 M for 24 h; c) 50 M for 3 h an

18、d d) 50 M for 24 h.Table 5Percentage of apoptotic, dead and live cells after incubation with complex 10.Complex 10 (M)Incubation time (h)ApoptoticDeadAlive10352.1047.470.182458.4441.130.2350324.5974.910.042411.3688.460.04Fig. 5. FCM of ROS production using H2DCF-DA (2,7-dichlorodihydroflurescein dia

19、cetate).a) Control (non-treated cells); b) Positive control (cells incubated with500MH2O2.Cells incubated with complex 10 for 3 and 6 h at 10 and 50 M. c) 10 M for 3 h; d) 10 M for 6 h; e) 50 M for 3 h and f) 50 M for 6 h.Table 6Production of reactive oxygen species (ROS) by MCF-7 cells incubated with comple