1、一種基于一種基于SARS冠狀病毒冠狀病毒S蛋白的蛋白的新型靶向輸送生物仿真系統的研究新型靶向輸送生物仿真系統的研究 嚴重急性呼吸綜合癥（sever acute respiratory syndrome, SARS）于2002年11月首先在我國廣東省出現，此后該癥于2003年初在全球傳播。 至2003年6月SARS流行被控制為止，全球被確診的患者達到8098人，死亡人數774人；該病造成了巨大的經濟損失。 SARS出現不久，經過全球科學家多中心協作努力，鑒定出導 致 S A R S 的 元 兇 是 一 種 新 型 的 冠 狀 病 毒 （ S A R S coronavirus，SARS CoV）

2、。 SARS 冠狀病毒(SARS-Cov)，屬于巢狀病毒目(Order: Nidovirales),冠病毒科(Family: Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Genus: Coronavirus)。根據其基因組結構分類，它屬于單鏈正義RNA 病毒(+)sense, ssRNA Virus。成熟的冠狀病毒顆粒直徑約為60 至220nm 不等。其形態學上最顯著的特征在于，在病毒包膜(envelope)外，有明顯的棒狀膜外粒子(club-shaped peplomers)。這一酷似中世紀歐洲帝王王冠(crown)的結構，正是其”名字” - Coronavirus 的來源。S蛋白（蛋白（sp

3、ike-protein）即伸出包膜即伸出包膜的棒的棒-球形的糖蛋白，它在病毒與宿球形的糖蛋白，它在病毒與宿主細胞表面受體結合及介導病毒包膜主細胞表面受體結合及介導病毒包膜和細胞膜融合并進入細胞的過程中，和細胞膜融合并進入細胞的過程中，起關鍵性作用，也是冠狀病毒主要的起關鍵性作用，也是冠狀病毒主要的抗原蛋白。抗原蛋白。HE蛋白構成包膜的短突起，其可能蛋白構成包膜的短突起，其可能與冠狀病毒早期吸附有關，某些與冠狀病毒早期吸附有關，某些CoV的的HE蛋白可引起紅細胞凝集及對紅蛋白可引起紅細胞凝集及對紅細胞產生吸附細胞產生吸附M蛋白則是一種跨膜蛋白，在病毒的蛋白則是一種跨膜蛋白，在病毒的包膜形成與出芽

4、包膜形成與出芽(budding)過程中起過程中起重要作用。重要作用。E蛋白是一種相對較小的蛋白質，主蛋白是一種相對較小的蛋白質，主要散在分布于病毒包膜上。要散在分布于病毒包膜上。 N蛋白是一種堿性磷蛋白，其中央區蛋白是一種堿性磷蛋白，其中央區同基因組同基因組RNA結合，形成卷曲的核衣結合，形成卷曲的核衣殼蛋白殼蛋白S1能夠與細胞受體特異性結合，能夠與細胞受體特異性結合，S2介導病毒與細胞膜發生融合作用介導病毒與細胞膜發生融合作用 DNA測序結果表明SARS-CoV的S 蛋白長度為1256 個氨基酸 ，S2蛋白約600個氨基酸。 S2包括三個螺旋結構（helix）和一個穿膜區（11971218

5、aa） S2的三個螺旋結構是介導病毒包膜與細胞融合（membrane fusion）的關鍵結構；而穿膜區則將S蛋白固定在病毒包膜上 S1與特異性受體的高親和力結合并不能直接介導細胞融合，但卻可有效地驅動S2介導的細胞融合反應。 如果能找到細胞/組織特異性的高親和力結合肽，就有可能模仿或替代S1的功能，為S2介導的細胞融合反應提供動力，同時又可避免S1作為病毒抗原介導的免疫病理反應。利用噬菌體展示技術（phage display）篩選細胞/組織特異性的高親和力結合肽 Fusion proteinPIIIphenotypegenotype 噬菌體展示技術的本質就是在一個單一的噬菌體粒子當中遺傳基因

6、表型和蛋白表型的直接的對應關系 。 利用這種對應關系人們可以將各種自然界存在或不存在的DNA整合到噬菌體基因中，以重組蛋白的形式表達在噬菌體表面，從中篩選出人們所需的目的片斷。 外源基因融合于噬菌體不同區段外殼蛋白基因的表達模式34輪篩選將噬菌體文庫鋪在固定的誘餌上洗脫未結合的噬菌體加入宿主菌，擴增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫鋪盤分離單個克隆驗證結合實驗3-4輪經典噬菌體展示技術篩選流程圖實驗流程實驗流程基于基于SARS冠狀病毒冠狀病毒S蛋白介導細胞膜融合機蛋白介導細胞膜融合機制的生物仿真靶向輸送系統的設計理念制的生物仿真靶向輸送系統的設計理念實驗流程實驗流程評價蛋白定向輸入功能評價蛋白定向輸

7、入功能 該靶向輸送系統中融合蛋白后接綠色熒光蛋白（green fluoresence protein，GFP），可在熒光顯微鏡下動態觀察細胞內綠色熒光強度的變化，可用于研究這一系統攜帶外源蛋白特異性靶向進入細胞的能力。融合蛋白后接誘導細胞凋亡的蛋白或多肽，如MKK6(E)，檢測A549 細胞的凋亡情況，用于研究這一系統攜帶凋亡誘導蛋白靶向導入肺癌細胞，從而殺滅肺癌細胞的能力。 近年來我國的肺癌發病率明顯上升，在一些大中城市肺癌已占常見惡性腫瘤的首位。 生物靶向治療已逐漸成為一種新的腫瘤治療策略。本靶向輸送系統，巧妙地利用了SARS-CoV特異性侵襲肺組織的分子進化機制，結合腫瘤靶向多肽和可誘導肺癌細胞凋亡的蛋白或多肽，靶向輸送殺滅腫瘤細胞，具有良好的開發應用前景和實踐意義。研究意義研究進展T載體中保存的S1，S2片段S1markerS2T-S1T-S2digestion(T-S1)digestion (T-S2)1500bp _ 2000bp _3000bp _4000bp _1000bp _750bp _研究進展pET-14b-S2質粒的構建質粒的構建markerS2pET-14b-S2digestion(pET-14b-S2)pET-14b Vector1500bp _2000b