1、常用生化檢測項目分析方法舉例1 .終點法檢測 常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結合膽紅素（氧 化法或重氮法）、血活總蛋白（雙縮脈法）、血活白蛋白（漠甲酚氯法）、總膽 汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽 固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直 接測定法）、鈣（偶氮不申m法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。以上 項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。2 .固定時間法苦味酸法測定肌酊采用此法。3 .連續監測法

2、 對于酶活性測定一般應選用連續監測法，如丙氨酸氨基轉 移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、y谷氨氨酰基轉移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脈 酶偶聯法測定尿素等，也可用連續監測法。4. 透射比濁法 透射比濁法可用于測定產生濁度反應的項目，多數屆免疫比濁 法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風濕因子，以及血活中的其他蛋 白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等均可用此法。二、分析參數設置 分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測、數據處理等，其程序均 已經固化在存儲器里，用戶不能修改。各種測定項目的分析參數（

3、 analysis p aramete）大部分也已設計好，存于磁盤中，供用戶使用；目前大多數生化分析 儀為開放式，用戶可以更改這些參數。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空 白通道，由用戶自己設定分析參數。因此必須理解各參數的確切意義。一、分析參數介紹（一）必選分析參數這類參數是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數無法進行檢測。1 .試驗名稱 試驗名稱（test code ）是指測定項目的標示符，常以項目的英文 縮寫來表示。2. 方法類型（也稱反應模式）方法類型（assay）有終點法、兩點法、連續監 測法等，根據被檢物質的檢測方法原理選擇其中一種反應類型。3. 反應溫度 一般有30C、37C可供

4、選擇，通常固定為 37Co4. 主波長 主波長（primary wavelength ）是指定一個與被測物質反應產物的光 吸收有關的波長。5. 次波長 次波長（secondary wavelength ）是在使用雙波長時， 要指定一個與 主波長、十擾物質光吸收有關的波長。6. 反應方向 反應方向（response direction ）有正向反應和負向反應兩種，吸 光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。7. 樣品量 樣品量（sampling volum ） 一般是2 l35 l,以0.1 l步進，個別分析儀最少能達到1.6 l。可設置常量、減量和增量。8. 第一試劑量 第一試劑量（firs

5、t regengt volum ） 一般是20300 l ,以1 11步進。9. 第二試劑量 第二試劑量(second regengt volum ) 一般也是20300l , 以1 l步進。10. 總反應容量 總反應容量(total reacting volum )在不同的分析儀有一個 不同的規定范圍，一般是180350 l ,個別儀器能減少至120 l。總反應容量 太少無法進行吸光度測定。11 .孵育時間 孵育時間(incubate time )在終點法是樣品與試劑混勻開始至反 應終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點 為止的時間。12. 延遲時間延遲時間(d

6、elay time )在連續監測法中樣品與反應試劑(第二 試劑)混勻開始至連續監測期第一個吸光度選擇點之間的時間。13. 連續監測時間 連續監測時間(continuous monitoring time )在延遲時間 之后即開始，一般為60120s,不少于4個吸光度檢測點(3個吸光度變化值)。14. 校準液個數及濃度 校準曲線線性好并通過坐標零點的，可采用一個校準液(calibrator )；線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液；對于校準曲線 呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一個校準液都要有一個合適的濃度。15. 校準K值或理論K值 通過校準得到的K值為校準K值(calibrate

7、coeffi cient )或由計算得出的K值為理論K值。16. 線性范圍 即方法的線性范圍(linearity range ),超過此范圍應增加樣品 量或減少樣品量重測。與試劑/樣品比值有關。17. 小數點位數檢測結果的小數點位數(decimal point digit )。(二) 備選分析參數這類分析參數與檢測結果的準確性有關，一般來說不設置這類分析參數，分析儀也能檢測出結果，但若樣品中待測物濃度太高等，檢測結果可能不準確。1 .樣品預稀釋 設置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個數值，便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋。2. 底物耗盡值 底物耗盡值(substrate exhaust li

8、mit )在負反應的酶活性測 定中，可設置此參數，以規定一個吸光度下降限。 若低于此限時底物已太少，不 足以維持零級反應而導致檢測結果不準確。3. 前區檢查免疫比濁法中應用，以判斷是否有抗原過剩。將終點法最后兩個吸 光度值的差別( A)設置一個限值，如果后一點的吸光度比前一點低，表示已 有抗原過剩，應稀釋樣品后重測。4. 試劑空白吸光度范圍 超過此設定范圍表示試劑已變質，應更換合格試劑。5. 試劑空白速率連續監測法中使用，是試劑本身在監測過程中沒有化學反應時 的變化速率。6. 方法學補償系數 用于校準不同分析方法問測定結果的一致性，有斜率和截距 兩個參數。7. 參考值范圍 對超過此范圍的測定結

9、果，儀器會打印出提示。(三) 某些參數的特殊意義1. 最小樣品量 最小樣品量是指分析儀進樣針能在規定的誤差范圍內吸取的最小 樣品量。一般分析儀的最小樣品量是 2 l ,目前也有小至1.6 l的。在樣品含 高濃度代謝產物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品量作為 減量參數，從而使分析儀檢測范圍(與線性范圍不同)的上限得以擴大。2. 最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測項目， 如血活白蛋白的漠甲 酚氯法測定，以往手工法操作時樣品量10l ,試劑量4ml,這樣試劑量/樣品量 比例（R/S）為200,線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上后，R/S卻很難 達到200,致使線性上

10、限變低。因此對這類檢測項目最大試劑量非常重要。3 .彈性速率 在酶活性測定中，當酶活性太高，在連續監測期中已不呈線性反應 時，有些儀器具有彈性速率（flexrate ）功能，能自動選擇反應曲線上連續監測 期中仍呈線性的吸光度數據計算結果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大。如 A ST可從1000U/L擴展至4000U/L,從而減少稀釋及重測次數、降低成本。4.試劑空白速率 當樣品中存在膽紅素時，膽紅素對堿性苦味酸速率法或兩點法 測定肌酊有負十擾。因為膽紅素在肌酊檢測的波長505nm有較高光吸收，而且膽 紅素在堿性環境中可被氧化轉變，因而在肌酊反應過程中膽紅素的光吸收呈下降 趨勢。若在加入第一試劑

11、后一段時間內設置試劑空白速率，因為此段中苦味酸尚未與肌酊反應，而膽紅素在第一試劑的堿性環境中已同樣被氧化轉變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負十擾， 見圖7-8。二、單波長和雙波長方式（一）概念采用一個波長檢測物質的光吸收強度的方式稱為單波長 （mono-wavelength）方 式。當反應液中含有一種組分，或在混合反應液中待測組分的吸收峰與其它共存 物質的吸收波長無重疊時，可以選用。在吸光度檢測中，使用一個主波長和一個 次波長的稱雙波長方式。當反應液中存在十擾物的較大吸收、從而影響測定結果 的準確性時，采用雙波長方式更好。（二）雙波長的作用雙波長（di

12、-wavelength）測定優點是消除噪音十擾；減少雜散光影響；減少 樣品本身光吸收的十擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統中， 均存在著隨時間發生變化的不穩定的檢測信號，即噪音，而雙波長檢測是同時進行的，兩種波長檢測產生的噪音基本上相同，因而能消除噪音十擾。當樣品中存在非化學反應的十擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產生非特異性的光吸收，而十擾測定結果的準確性。采用雙波長方式測定可以部分消除這類十擾， 提高檢測的準確性。（三）次波長的確定方法當被測物的主波長確定之后，再選擇次波長。如根據甘油三酯等十擾物吸收光譜 特征，選擇次波長，使十擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收

13、值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應有較大的差異。一般來說，次波長應大于主波長100nm以主波長與次波長吸光度差來計算結果。（四）雙波長的具體應用對于某些反應速度快且無法設置為兩點終點法的分析項目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長的方式來部分消除樣品本身的光吸收十擾。目前用單試劑法測定的項目應用雙波長的為血活總蛋白（雙縮脈法）主波長 500nm次波長576 ng血活白蛋白（漠甲酚氯法）主、次波長分別為600和700nm鈣（偶氮砰用法）主、次波長分別為660、770nm磷（紫外比色法）主、次波長為 340、405 nm鎂（二甲苯胺藍法）主、次波長為 505和600nm。三、單試劑和雙試劑方式

14、反應過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生 化分析儀大多可用雙試劑方式分析， 其優點是：可提高試劑的穩定性，多數雙 試劑混合成單一工作試劑時，其穩定時間縮短；能設置兩點終點法，來消除來 自樣品本身的光吸收十擾；在某些項目檢測時能消除非特異性化學反應的十 擾。如血活ALT測定，血活中的內源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶(乳酸脫氫酶)起反應，使結果偏高。若先加入缺乏a -酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應之后再加入含有a -酮戊二酸的第二試劑，啟動真正的ALT酶促反應生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應消耗的NADH能真正反映ALT的活性，從而消除以上

15、副反應的影響。四、測定過程的自動監測各種自動生化分析儀或多或少都具有對測定過程進行各種監測的功能，以便在沒有人"監督"化學反應的情況下提高檢測的準確性。高檔分析儀的監測功能更強。1 .試劑空白監測 每種試劑都有一定的空白吸光度范圍， 試劑空白吸光度的改變 往往提示著該試劑的變質：如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因酚被氧化 為釀而變為紅色；堿性磷酸酶、Y -谷氨酰轉移酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質 分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃； 有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白 吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應檢測項目，其試 劑在放置過程中空白吸光度會

16、因 NAD由行氧化為NAD而下降等。試劑空白的測定方法有兩種：每瓶試劑在使用前通過對試劑空白校準來確定試 劑空白吸光度，這種方式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每個樣品測定前均檢測試劑空白吸光度，適用于先加試劑后取樣品的分析儀。2. 試劑空白變化速率監測 一些酶試劑在反應溫度下不穩定， 其空白吸光度可隨著時間逐漸發生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關，且因試劑的組成和生產廠家的不同而不同。 這種變化會影響測定結果的準確性， 一般使 結果偏高。如果設置此項監測，分析儀在結果計算時會自動減去試劑空白變化速 率。在以監測NAD( P) H減少為指示反應的酶活性測定中， 空白速率可監測并

17、消 除由NADH!身氧化所造成的吸光度下降；在色素原為底物的酶活性測定中，空 白速率可監測并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關空白速率監測在膽紅素對堿性苦味酸速率法測定肌酊負十擾消除中的作用，已如前述。3. 樣品信息監測 由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會對測定結果產生非化學反應的 十擾。根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質和 程度，一般是測定樣品在 600nn570nm 700nm/660nmft 505nm/480nm®光度比 值的大小來分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結果計算時自動減去這 部分十擾，這將有利于提高分析結果的可靠性。4. 結果可靠性監測(1) 終點監測：終點法測定要判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。一些 分析儀在所選終點后再選一個測光點，比較這兩點吸光度的差異來判斷反應是否 到達終點。(2) 線性期監測：連續監測法選擇時間-吸光度反應曲線上的線性期來計算酶活性或被測物濃度，因此儀器要確定此連續監測期是否呈線性。其監測方法為 將連續監測到的各吸光度值進行線性回歸，計算出各點的方差，根據方差值的大小來判斷是否呈線性；取連續監測期開始若十點的變化速率與連續監測期最后