1、構建RFP在宿主中的表達載體并表達蛋白實驗思路pCR2.1cutlinkTarget SequenceOrigin Vector VectorHostHosttransfectProteindetected第1頁/共32頁方案流程查找載體、宿主信息查找基因序列表達載體篩選載體轉染宿主構建表達載體設計擴增引物轉染結果篩選蛋白表達檢測第2頁/共32頁查找載體信息pCR2.1 TOPOTA載體第3頁/共32頁查找宿主信息香菇（Lentinus edodes）是一種重要的藥食兩用真菌，產量僅次于雙孢菇。1998年，Sato等以香菇原生質體為材料用限制性酶介導法首次成功轉化香菇，將外源基因組整合到香菇的

2、基因組中。2001年，孫麗等采用PEG(polyethylene glycol , 聚乙二醇)介導法在我國首次建立了香菇遺傳轉化體系。2008年，Kuo等建立了香菇電擊法遺傳轉化體系。2009年，喻義贛等建立了香菇根癌農桿菌介導的遺傳轉化研究體系。第4頁/共32頁RFP基因序列查找Addgene紅色熒光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是從海葵Discoso-masp中分離出的一種新的熒光蛋白基因,其蛋白質的最大吸收光譜為583 nm，不需要任何預處理便可檢測到。紅色熒光蛋白因其紅熒光較強的組織穿透力，已被廣泛用于動物、植物和酵母等真核細胞內基因表達的報告基因。第

3、5頁/共32頁啟動子序列查找題目要求網絡搜索L. edodes beta-肌動蛋白啟動子和終止子，但我們沒能檢索到任何信息，故改用其他啟動子。在香菇中較為常用的啟動子主要有兩種：ras基因的啟動子和gpd基因的啟動子。我們選用了香菇自身的gdp強啟動子，因為相比ras，gpd能更有效地驅動外源基因的表達。根據己發表的香菇gpd啟動子序列(郭麗瓊等2007)，選擇活性最強的Lgpd1啟動子，并相應設計引物。第6頁/共32頁潮霉素抗性基因序列查找通過網絡搜索我們獲知：在piggyBac-IRES-Hygromycin等質粒載體中都含有潮霉素抗性基因可通過購買或索取質粒以獲取HPH序列。插入潮霉素抗

4、性基因原因：在轉染完成后，利用潮霉素培養基培養，篩選陽性重組子。因為外源DNA整合到染色體中概率很小，有報道表明大約1/104轉染細胞能整合，因此通常需要通過一些選擇性標記，如潮霉素B磷酸轉移酶（HPH）、氨丙基轉移酶（APH，新霉素抗性基因）等。第7頁/共32頁M13F: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGTM13R: 5CAG GAA ACA GCT ATG ACC PF: 5CTTCGCATAGCGGGATCATAPR: 5GTTCCCTATTATTGAGATCTTCATAGAAACAGTCGGCTCCTCAAGRFPF: 5CTTGAGGAGCCGACTGTTTCTATG

5、AAGATCTCAATAATAGGGAACRFPR: 5CCCCTGACGAGCATCACAAAATTAATCAGGAATCCCTAGTATTTTTAHPHF: 5CCGCTCGAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG (Xhol)HPFR: 5GCTCTAGACTATTCCTTTGCCCTCGGAC (Xbal)引物設計合成M13 RM13 FPRPFRFPRHPHFHPHRRFPFXho lXba lM13F與M13R為載體上的保守序列引物，后期用于鑒定第8頁/共32頁準備工作1、獲取各基因序列來源材料包括V22 CS2+ RFPce （RFP來源）、香菇基因組（Lgfp1啟動子來

6、源）、 piggyBac-IRES-Hygromycin （潮霉素抗性基因來源）2、獲取連接、轉化、膠回收用試劑（盒）3、引物合成（見前頁）4、其他基本儀器及材料試劑第9頁/共32頁串聯原件準備用重疊PCR方法，使用兩對引物（PF/PR和RFPF/RFPR）擴增出包含啟動子序列和RFP基因序列的拼接序列。（先使用pfu 酶擴增，再使用Taq 酶處理擴增產物，在兩端添加A）用HPH擴增引物（HPHF/HPHR）在其載體質粒（piggyBac-IRES-Hygromycin）中擴增出兩端分別添加了 XhoI 和 XbaI 酶切位點的片段。第10頁/共32頁串聯原件構建載體1、TA連接（啟動子+RF

7、P基因） 2、酶切連接（ IRES-hygromycin-終止子序列片段）啟動子RFPIRES-Hygromycin-TerminatorIRES是內部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site, IRES）能招募核糖體，繼續翻譯Hygromycin。第11頁/共32頁串聯原件構建載體將pCR2.1載體、重疊PCR擴增所得目的基因片段按試劑盒所給體系進行連接。連接產物中即包含了成功將【啟動子+RFP基因】元件插入pCR2.1載體的成分。再通過下一步的篩選可以得到陽性的質粒載體。1.TA連接第12頁/共32頁TA連接篩選驗證將TA連接反應產物轉化感受態細胞DH5

8、（冰浴30min，立即42熱激90s，再次冰浴2-5min）轉化產物涂Amp/Kana抗性平板培養篩選，涂板前加涂IPTG & Xgal進行藍白篩選。待菌落長成（約37下8-12h），挑取白色菌落進行菌落PCR（引物選取M13R和PR）.選取有目的條帶（約1100bp）的對應菌落進行測序，確認后返還質粒。該質粒即已成功插入了目的基因。第13頁/共32頁串聯原件構建載體HPH序列連接 雙酶切選擇Xba & Xho:Buffer2/4 + BSA ( NEB )將載體和擴增片段都進行雙酶切后，凝膠電泳，膠回收目的片段，將載體片段和目的基因片段按試劑盒要求進行連接反應，得到連接產物。

9、2.潮霉素抗性基因插入第14頁/共32頁HPH插入篩選驗證將酶切連接反應產物轉化感受態細胞DH5 （冰浴30min，立即42熱激90s，再次冰浴2-5min）轉化產物涂Amp/Kana抗性平板培養篩選。待菌落長成（約37下8-12h），挑取白色菌落進行菌落PCR（引物選取HPHF和M13F）.選取有目的條帶(約1kb)的對應菌落進行測序，確認后返還質粒。該質粒即已在前面基礎上又成功插入了潮霉素抗性基因。還可進行雙酶切-電泳驗證。第15頁/共32頁載體轉染宿主將以上獲得最終質粒轉染香菇原生質體。外源基因進入細胞主要有四種方法：電激法、磷酸鈣法、脂質體介導法和病毒介導法。1）電激法是在細胞上短時間

10、暫時性的穿孔讓外源質粒進入；2）磷酸鈣法和3）脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；4）病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。人工脂質體法采用陽離子脂質體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質.此外，脂質體體外轉染同時適用于瞬時表達和穩定表達。第16頁/共32頁載體轉染宿主脂質體介導法實驗步驟：1、取少量于25 PDB培養基中靜止培養7d的香菇菌絲，用0.6 mol/L甘露醇洗滌兩次后加入l mL溶壁酶溶液(質量濃度1.5

11、 mgmL，用0.6 molL甘露醇溶液配制)，于30 酶解23 h，酶解后用血球計數板對原生質體計數，稀釋至l108個mL。2、在100uL原生質體溶液中加入1.5ug構建的質粒，冰浴30 min后加入25uL 60PEG溶液，冰浴10min，隨后加入0.5 mL 60PEG溶液，室溫作用10 min，再加入l mL CYM再生培養基進行稀釋后倒入滅菌平皿中，加入大約10 mL CYM半固體培養基，在25 培養至原生質體再生。加入含有15ugmL潮霉素的PDA培養基，25 條件下繼續培養得到香菇轉化子。第17頁/共32頁轉染結果驗證篩選挑取轉染得到的香菇轉化子，轉接到含有50ugmL潮霉素的

12、PDA平板中，待菌落長滿平板后，刮取菌絲采用CTAB法提取基因組DNA，分別PCR擴增RFPF基因和PHP基因，進行驗證。1、陽性轉化子才能在含潮霉素的培養基上生長。2、只有整合到宿主染色體上，才能擴增出目的片段。第18頁/共32頁蛋白表達驗證蛋白表達檢測：1、熒光顯微鏡觀察在熒光顯微鏡下觀察樣品是否有紅色熒光產生2、Western Blot提取總蛋白，將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，然后通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印到固相支持物上。用抗紅色熒光蛋白的非標記抗體（一抗）與膜進行雜交，使抗體與靶蛋白特異性結合后，再與經辣根過氧化物標記的二抗

13、結合，最后用ECL試劑反應，經X線片曝光、顯影等一系列反應，達到檢測靶蛋白的目的。第19頁/共32頁【1】姚強等，海峽兩岸第十屆菌物學暨第三屆食藥菌學術研討會，Swollenin基因香菇表達載體的構建及遺傳轉化研究【2】劉巖等，食品科學，擴張蛋白Swollenin基因香菇表達載體構建及其初步轉化【3】于曉玲等，食用菌學報，香菇ras和gpd啟動子的克隆與功能鑒定【4】茱莉莎，碩士論文，結球白菜中抗寒基因的克隆及香菇表達載體的構建參考文獻第20頁/共32頁第21頁/共32頁關于-actin promoter & terminator的獲取因為我們沒能在網上搜索到香菇-actin啟動子和終

14、止子的相關信息，所以就換用了ras啟動子。若要用香菇-actin啟動子和終止子，可根據-actin在同源物種中保守的特點，針對香菇同源物的保守區設計引物，再對香菇基因組進行PCR擴增，對擴增片段進行測序，進行分析后可得到其序列信息。第22頁/共32頁載 體 序 列5 CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG GAA TTC GCC CTT AAG GGC GAA TTC TGC AGATAT CCA TCA CAC TGG CGG

15、 CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAC AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC3Spe lBstX lEcoR lEcoR VNot lXho lNsi lEcoR lBstX lXba lApa lT7 PromoterHind lllKpn lSac lBamH lM13 Reverse PrimerlacZ ATGM13 Forward Primer第23頁/共32頁問題1、gpd是什么基因？gpd在香菇中編碼

16、三磷酸甘油醛脫氫酶 是一個持家基因。2、為什么本例中，蛋白表達不需要誘導？因為本例中用的啟動子是香菇本身的啟動子，而且是一個持家基因啟動子，在正常條件下就可以表達，不需要誘導。3、有個說法錯誤：本例中是用質粒載體去“轉化“香菇原生質體，而不是”轉染”。轉化VS轉染轉化： 轉化特指將質粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內。轉染：轉染的定義是“將具生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能”。第24頁/共32頁選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。載體選擇主要考慮下述3點：【

17、1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。【2】.載體的類型：（1）克隆載體的克隆能力據克隆片段大小（大選大，小選小）。如10kb選質粒。（2）表達載體據受體細胞類型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。（3）對原核表達載體應該注意：選擇合適的啟動子及相應的受體菌，用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。第25頁/共32頁啟動子序列查找題目要求網絡搜索L. edodes beta-肌動蛋白

18、啟動子和終止子，但我們沒能檢索到任何信息，故改用其他啟動子。在香菇中較為常用的啟動子主要有兩種：ras基因的啟動子和gpd基因的啟動子。我們選用了香菇自身的gdp強啟動子，因為相比ras，gpd能更有效地驅動外源基因的表達。根據己發表的香菇gpd啟動子序列(郭麗瓊等2007)，選擇活性最強的Lgpd1啟動子，并相應設計引物。第26頁/共32頁潮霉素抗性基因序列查找通過網絡搜索我們獲知：在piggyBac-IRES-Hygromycin等質粒載體中都含有潮霉素抗性基因可通過購買或索取質粒以獲取HPH序列。插入潮霉素抗性基因原因：在轉染完成后，利用潮霉素培養基培養，篩選陽性重組子。因為外源DNA整合到染色體中概率很小，有報道表明大約1/104轉染細胞能整合，因此通常需要通過一些選擇性標記，如潮霉素B磷酸轉移酶（HPH）、氨丙基轉移酶（APH，新霉素抗性基因）等。第27頁/共32頁載體轉染宿主脂質體介導法實驗步驟：1、取少量于25 PDB培養基中靜止培養7d的香菇菌絲，用0.6 mol/L甘露醇洗滌兩次后加入l mL溶壁酶溶液(質量濃度1.5 mgmL，用0.6 molL甘露醇溶液配制)，于30 酶解23 h，酶解后用血球計數板對原生質體計數，稀釋至l108個mL。2、在10