1、2試驗方法2.1試驗設(shè)計試驗采用盆栽試驗的方法，將苗木移栽入合適的花盆中，給予較好的管護。待苗木成活生長 穩(wěn)定后開始試驗。每個品種都設(shè)置對照株（給v充足水分）。試驗組以時間為梯度 （0d,6d,12d,18d,24d,30d,36d）,采用自然干旱的辦法,每隔6天對各項指標(biāo)進行監(jiān)測,同時監(jiān)測 土壤中水分的變化。2.2指標(biāo)及監(jiān)測方法2. 2.1葉片水分狀況（1）組織含水量的測定儀器和用具：電子天平（感量o.lmg）,烘箱，剪刀，100ml燒杯，鋁盒，吸水紙試劑：剪取組織，迅速放入已知重量的鋁盒中，稱出鮮重（wf）；然后將組織浸入蒸憎水中6-8h, 収出用吸水紙擦干表面水分，稱重，再將組織浸入蒸僧

2、水中l(wèi)h,擦干稱重，直至組織重量穩(wěn)定恒 重，既得樣品飽和鮮重（wt）；然后將組織連同鋁盒放入己升溫至105°c的烘箱中，殺青15min, 然后于80°c下烘至恒重，稱出干重（wd）；組織含水量（占鮮重）=（wf-wd）100%/wf組織含水量（占干重）二（wf-wd）100%/wd相對含水量（rwc） = （wf- wd） 100%/ （wt- wd）水分飽和虧（wsd） =1-rwc（2）離體葉片保水力測定剪取各個品種各個處理葉片迅速將其插入蒸懈水中，飽和3小時以上，取出葉片，剪去葉柄， 稱量葉片重量。然后將葉片懸于室內(nèi)，在空氣中緩慢脫水（記錄室溫和rh）,每隔兩個小吋稱

3、重 一次，稱4次后，知道24小時再稱重1次，將葉片在80°c下烘干稱干重。根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算出 每次稱重時的葉片含水量，再以脫水時間對葉片相對含水率作圖，可得葉片保水力的差異。2. 2. 2光合指標(biāo)（1）葉綠素a、葉綠素b、葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定儀器和用具：分光光度計，研缽一套，剪刀，玻棒，25ml棕色容量瓶3個，小漏斗3個，直 徑7cm定量濾紙，吸水紙，擦鏡紙，滴管，電子天平（o.olg感量）試劑：96%乙醇，石英砂，碳酸鈣粉a取不同油茶吊種苗木的新鮮葉片，擦凈表面剪碎（去掉屮脈），混勻。b稱取剪碎的新鮮樣品0.2g （共三份），放入研缽加入少量石英砂和碳酸鈣粉及2-3ml96

4、%乙 醇研成勻漿，再加入乙醇10ml,繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3-5minoc取濾紙一張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提収液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容 量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。d用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容暈瓶屮，直至濾紙和殘渣屮無綠色為 止，最后用乙醇定容至25ml,搖勻。e把葉綠體色素提取液倒入比色杯，以96%乙醇為空白，在波長665、649、470nm下測定消 光度。ca二 13.95。6656.88。649cb=24.96d649732d665cx .c=（1000d47（）-2.05ca-ll 4.8cb） /

5、245葉綠素含量（mg/cn?）二葉綠素濃度x提取液總體積x稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 葉綠素a含量（mg/cm2）二葉綠素濃度x提収液總體積x稀釋倍數(shù)/樣品鮮重葉綠素b含量（mg/cn?）二葉綠素濃度x提取液總體積x稀釋倍數(shù)/樣品鮮重類胡蘿卜素含量（mg/cm2）二葉綠素濃度x提取液總體積x稀釋倍數(shù)/樣品鮮重（2）光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率的測定用lico-6400便攜式光合測定分析儀（美國）進行光合測定，在不同處理的樹冠中部向陽選収正 常生長的功能葉，測定葉片的凈光合速率（pn）、蒸騰速率（tr）、氣孔導(dǎo)度（gs）、胞間co?濃 度（ci）,并計算水分利用效率（wue） =pn/t

6、ro每個樣品至少3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。2. 2. 3生理生化指標(biāo)（1）丙二醛的測定采用硫代巴比妥酸（tba）比色法測定。樣品提取方法與酶夜提取相同。測定時向具塞試管 中加入2ml樣品提取液和3ml 0.5%硫代巴比妥酸（tba）溶液（用5%乙酸溶液溶解定容），沸 水浴屮煮沸l(wèi)omin后取出流水冷卻，3000xg離心15min取上清液，以0.5%tba為空白調(diào)零，分 別在波長532nm, 600nm和450nm下測od值。結(jié)果按下式計算：丙二醛含量（nmol 才fw） =6.452x （d532-d6（x）-0.559xd450 x vxvtx/（wxvs） 式中，v：反應(yīng)液總量，ml； vt

7、：提収液總體積，ml； vs：測定用提取液體積，ml； w：樣品 鮮重，go（2）游離脯氨酸含量測定采用堿基水楊酸提取，苗三酮顯色法測定。a制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7支25ml具塞試管，編號，按下表2-2加入試劑：表2-2游離脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液組成tab.2-2 solution compositin of standard curve of free proline試劑1234567脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（loug/ml）00.20.40.81.21.62.0蒸餡水（ml）2.01.81.61.20.80.40冰醋酸（ml）2222222苗三酮（ml）2222222甲苯（ml）5555555脯氨酸含量（u g

8、）0248121620分別向各管準(zhǔn)確加入脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，再用蒸徭水將體積補至2ml,搖勻。再向各管中加入冰 酷酸和酸性即三酮各2ml。搖勻后，在沸水浴中加熱顯色30min,収出后冷卻至室溫，向各管加 入5ml甲苯，充分搖動，以萃取紅色產(chǎn)物。萃取完后，避光靜置4h以上。待完全分層后，用吸 管吸取甲苯層，用分光光度計在520nm波長下測定，以脯氨酸含雖為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b磺基水楊酸提取：取各苗木的葉片，裝入塑料袋中，迅速帶回實驗室。稱取o.lg新鮮樣品 放入具塞試管中，加入5ml3%的磺基水楊酸溶液，加蓋，將試管浸入沸水浴中提収15min,過濾， 濾液待測。c測定：吸取濾液2

9、ml于試管內(nèi)，與標(biāo)準(zhǔn)液濃度的脯氨酸系列溶液同法顯色測定。計算：測 定結(jié)果按下式計算：游離脯氨酸含量（臨g'fw） =cx（v/a）/w式中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得脯氨酸微克數(shù)；v：提取液總體積ml； a：測定時取用提取液 ml； w：樣品鮮重g。（3）可溶性蛋白含量測定釆用考馬斯亮藍g-250法a制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支15ml具塞刻度試管編號，按下表2-3加入試劑。加完試劑后蓋上 玻璃塞，將溶液混勻，放置2-3min后，在595nm波長下測定吸光度（注意應(yīng)在lh內(nèi)完成比色）。以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b樣品測定：取0.2g樣品，加水研磨成勻漿后，定容于10ml

10、容量瓶中，取部分于5000x& 下離心lomin,準(zhǔn)確吸収上清液o.lml,加入0.9ml水和5ml考馬斯亮藍g-250試劑，充分混合， 放置2-3min后在595nm波長下記錄吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。表2-3可溶性蛋口質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液組成tab.23 solution composition of standard curve of soluble protein試劑123456牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（100 u g/ml）00.20.40.60.81.0水(ml)1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍g-250（ml）555555蛋白質(zhì)含量（ug）020406080100c

11、結(jié)果計算：樣品中可溶性蛋白質(zhì)含量（mg gdfw） =cx（v/a）/（wx1000）式中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定管中含蛋白質(zhì)的量（pg）； v：提収液總體積 5l）； a：測定時加樣量（ml）； w：樣品鮮重（g）； 1000：換算系數(shù)，1 mg=1000ug。（4）可溶性糖含量測定采用蔥酮比色法測定。a提取分離：取0.1g-0.2g樣品，研磨，用8ml80%乙醇分4次洗入10ml離心管中，80°c水 浴中提取30min,其間搖動幾次。3500xg離心10min,上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中；再向沉淀中 加入5-6ml80%乙醇，如上法重復(fù)浸提2次，將上清液合并于25ml容量瓶

12、中，定容至刻度。b制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支18x180ml試管編號，按下表24加入試劑：表2-4可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液組成tab.2-4 solution compositon of standard curve of soluble sugar試劑123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（100 u g/ml）00.20.40.60.81.0水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔥酮-硫酸（ml）555555葡萄糖含量（ug）020406080100加完試劑在100°c水浴中準(zhǔn)確加熱10min后取出流水冷卻，以1號管為空白調(diào)零，在620nm 波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，

13、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。c樣品屮可溶性糖含量的測定取上述測定還原糖剩余的樣品液適當(dāng)稀釋后取2ml,再加入 5ml蔥酮硫酸，與標(biāo)準(zhǔn)管同樣操作，記錄620nm波長下的吸光度。結(jié)果計算：可溶性糖含量（mg g“fw） = cx（v/a） xn/（ wx1000）式中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定管中含衙萄糖的量（ug）； v：樣品提取液總體積， ml； a：測定時取樣體積，ml； w：樣品鮮重，g； n：稀釋倍數(shù)；1000：換算系數(shù)，1 mg=1000 ug。（5）保護酶活性的測定a酶液的制取稱取0.5克鮮重葉片，加入1ml磷酸緩沖液，冰浴研磨，研磨后加入提収介質(zhì)（磷酸緩沖液 ph=7.8, 0.05mol/

14、l）沖洗 23 次，定容至 10ml。低溫（0-4°c）離心 20min,12000rpm,離心后上 清液即為粗酶提取液冷藏保存。b超氧化物歧化酶（sod）活性的測定表2-1 sod活性測定反應(yīng)系統(tǒng)tab.2-1 reaction system of sod actibity assay試劑(ml)樣品ck1ck250mmol/l磷酸緩沖液(ph7.8)1.51.51.5130mmol/l met 溶液0.3().30.3750 u mol/l nbt 溶液0.30.30.3looumol/l edta-na2 溶液0.30.30.320 u mol/l核黃素0.30.30.3粗酶液

15、000蒸餡水0.50.60.6氮藍四畔(nbt)比色法，sod酶活性以抑制50%nbt反應(yīng)為一個酶活性單位。按照表21加 入試劑后，混勻，ck1遮光，ck2不遮光，與其它各管同時置養(yǎng)箱中4000lux下照光30min,溫 度25-35°co反應(yīng)結(jié)束后，遮光終止反應(yīng)。以ck1對照管為空白調(diào)零，在560nm波長下測定吸光 度。以抑制nbt光化還原的50%為一個酶活力單位(u),結(jié)果用ug'fwh"表示。sod 活性(u g'fw h") = (ao - as) xvtx60/ (0.5x a()x wx asxt)式中，ao：照光對照管光吸收值；as：

16、樣品管的光吸收值；60： 60min換算；vt：提収液總 體積，ml； vs：測定用酶液體積，ml； w：樣品鮮重，g； t：照光時間min。c pod活性的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法，每隔30秒記錄1次，以每分蝕內(nèi)a470每下降0.1為一個活性單位。 3.0ml 反應(yīng)體 0.2%愈創(chuàng)木酚 0.9ml, 0.3%h2o2 l.oml, 50mmol/l ph7.0 磷酸緩沖液 l.oml,酶液 0.1 ml,反應(yīng)溫度25°c。加入酶液后記錄3min內(nèi)波長470nm處每30s的吸光值變化，以od值 變化0.1為一個酶活力單位(u),結(jié)果用ugfw min"表示。結(jié)果計算按pod

17、活性(u gjfw mii?)=卜2必乂 (0.1 xwxvsxt)式中，a a47o： a470在0-3min的差值；vt：提取液總體積，ml； vs：測定體積，ml； w： 樣品鮮重，g； t：酶反應(yīng)時間，mimd cat活性的測定用紫外吸收法，以每分鐘內(nèi)a240每下降0為一個酶活力單位。3.0ml反應(yīng)體系包括0.3% h2o21.0ml, 50mmol/l ph7.0磷酸l.oml,酶液o.lml。反應(yīng)溫度25°c。加入酶液后記錄3min 內(nèi)波240nm處每吸光值變化，以每分鐘od值變化0.1為一個酶活力單位(u),結(jié)果用ug，f wmin"表示。結(jié)果計算按下式cat

18、 活性(u g'fw min") = a a24o x vt/ (0xwxvsxt)式中，aa240： a240在0-3min的差值；vt：提取液總體積，ml； vs：測定體積，ml； w： 樣品鮮重，g； t：開始加h2o2到最后一次讀數(shù)時間，min0(6) 膜通透性的測定儀器和用具：電導(dǎo)儀，真空泵(附真空干燥器)一套，恒溫水浴器一具，水浴試管架一個, 具塞刻度試管，打孔器或雙面刀片，10ml移液管，試管架，鋁鍋，電爐，鐵子，剪刀，搪瓷盤, 記號筆，濾紙。塑料紗網(wǎng)(3cn?)試劑：去離子水a(chǎn)將處理組和對照組葉片用去離子水沖洗2次，再用潔凈濾紙吸凈表面水分，用6-8mm的打 孔器避開主脈打取葉圓片，每組葉片打取葉圓片30片，分別裝在3支潔凈的刻度試管中，每個 處理放10片。b在裝有葉片的各管中加入10ml去離子水，并將大于試管口徑的塑料紗網(wǎng)放入試管距離液 而lcm處，以防止葉圓片在抽氣時翻出試管。然后將試管放入真空干燥器中用真空泵抽氣10min