1、蛋白質(zhì)與酶工程曹友677843智能實(shí)驗(yàn)樓N教材教材與其他課程的關(guān)系與其他課程的關(guān)系前期課程主要有：前期課程主要有：有機(jī)化學(xué)，有機(jī)化學(xué)，生物化學(xué)，微生物生物化學(xué)，微生物學(xué)，學(xué)，分子生物學(xué)分子生物學(xué)等。等。交叉交叉課程有：課程有：細(xì)胞工程細(xì)胞工程，基因工程基因工程，發(fā)酵工程發(fā)酵工程等。等。教學(xué)安排與考核方式教學(xué)安排與考核方式 總學(xué)時(shí)：32學(xué)時(shí) （1-16周） 考核方式： 平時(shí)成績(jī) 50%（考勤、課堂表現(xiàn)、回答問題、課后作業(yè)） 曠課3次以上（含3次）的學(xué)生平時(shí)成績(jī)計(jì)為0分。 理論課考試成績(jī)50% （閉卷）Chapter 1 Introduction緒論Contents of

2、 chapter 11、酶的定義與酶工程2、酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史3、酶的分類命名4、酶的化學(xué)性質(zhì)與催化特性GoGoGoGo酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。定義定義：酶是生物體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝不可缺少的受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。酶具有一般催化劑的特征酶具有一般催化劑的特征：1.只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；的反應(yīng)；2.可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間，而不改變可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)；反應(yīng)的平衡點(diǎn)；3.通過降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度。通過降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度。酶的催化高效性酶的催化高效性通常要高出非生物催化劑

3、催化活性的1061013倍。2H2O22H2O + O21mol過氧化氫酶過氧化氫酶 5106 molH2O21mol離子鐵離子鐵 610-4molH2O21.1 酶的定義酶的定義回本章目錄酶工程（酶工程（ Enzyme Engineering）酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程。是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合形成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)。這門學(xué)科在研究?jī)?nèi)容、手段和目的上與基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等孿生學(xué)科是相互交融的。 1.2 酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史l人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。l夏禹時(shí)代，人們掌握了釀酒技

4、術(shù)。l公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。l春秋戰(zhàn)國時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。l酶者，酒母也酶酒l西方國家19世紀(jì)對(duì)釀酒發(fā)酵過程進(jìn)行了大量研究。直到1897年，德國巴克納Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母細(xì)胞，制備了不含酵母細(xì)胞的抽提液，并證明此不含細(xì)胞的酵母提取液也能使糖發(fā)酵，說明發(fā)酵與細(xì)胞的活動(dòng)無關(guān)。從而說明了發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，為此Buchner獲得了1911年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。l1894年,日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化劑,開創(chuàng)了有目的的進(jìn)行酶生產(chǎn)和應(yīng)用的先例。l1878年, 給酶一個(gè)統(tǒng)一的名詞，叫EnzymeEnzyme，這個(gè)字來

5、自希臘文，其意思“在酵母中”。l后來對(duì)酶的作用機(jī)理及酶的本質(zhì)做了深入研究，l1930年，證實(shí)酶是一種蛋白質(zhì)；l80年代初發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，開辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域，l現(xiàn)已鑒定出4000多種酶，數(shù)百種酶已得到結(jié)晶，而且每年都有新酶被發(fā)現(xiàn)。l1908年,德國的羅姆制得胰酶,用于皮革的軟化。l1908年,法國的波伊登(Boidin)制備了細(xì)菌淀粉酶,應(yīng)用于紡織品的退漿。l1911年,美國的華勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。l此后,酶的生產(chǎn)和應(yīng)用逐步發(fā)展。然而在50年代以前停留在從微生物，動(dòng)物

6、或植物中提取酶,加以利用階段.由于當(dāng)時(shí)生產(chǎn)力落后,生產(chǎn)工藝較繁雜,難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。酶的應(yīng)用歷史酶的應(yīng)用歷史l1949年,用液體深層培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn),揭開了近代酶工業(yè)的序幕。l50年代以后,隨著生化工程的發(fā)展,大多數(shù)酶制劑的生產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物流體深層發(fā)酵的方法。酶的應(yīng)用越來越廣泛。l50年代：開始了酶固定化研究。1953年德國科學(xué)家首先將聚氨基苯乙烯樹脂與淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等結(jié)合,制成了固定化酶。l60年代，是固定化酶技術(shù)迅速發(fā)展的時(shí)期。1969年,日本的千煙一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。出現(xiàn)了“酶工程”這個(gè)名詞來代表有

7、效利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。l1971年第一屆國際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議在美國召開,當(dāng)時(shí)的主題即是固定化酶，進(jìn)一步開展了對(duì)微生物細(xì)胞固定化的研究。l1973年,千煙一郎首次利用固定化的大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)L-天冬氨酸。l1978年,日本的鈴木等固定化細(xì)胞生產(chǎn) -淀粉酶研究成功.所以說,70年代是固定化細(xì)胞技術(shù)取得進(jìn)展的時(shí)期.l80年代，固定化細(xì)胞已能用于生產(chǎn)胞外酶,因此,80年代又發(fā)展了固定化原生質(zhì)體技術(shù),排除了細(xì)胞壁這一障礙。l在酶的固定化技術(shù)發(fā)展的同時(shí),酶分子修飾技術(shù)也取得了進(jìn)展。l60年代，用小分子化合物修飾酶分子側(cè)鏈基團(tuán),使酶性質(zhì)發(fā)生改變;l70年代,修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展。l此外,對(duì)

8、抗體酶,人工酶,模擬酶等方面,以及酶的應(yīng)用技術(shù)研究 ,在近20年均取得了較大進(jìn)展,使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展,顯示出廣闊而誘人的前景。回本章目錄1961年國際酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：1.3 酶的分類與命名酶的分類與命名酶的分類與命名酶的分類與命名 酶enzyme蛋白類酶（proteozyme）核酸類酶（ribozyme）核酸類酶 分子內(nèi)催化R酶（in cis ribozyme） 分子間催化R酶（in trans ribozyme）自我剪切酶（self-cleavage ribozyme）自我剪接酶（self-spli

9、cing ribozyme）RNA剪切酶（RNA cleavage ribozyme）DNA剪切酶（DNA cleavage ribozyme）多肽剪切酶（peptide cleavage ribozyme）多糖剪接酶（polysaccharide splicing ribozyme）氨基酸酯剪切酶（aminoacid ester cleavage ribozyme）多功能酶（multifunction ribozyme）蛋白類酶氧化還原酶（oxidoreductase）轉(zhuǎn)移酶（transferase）裂合酶（lyase）水解酶（hydrolase）異構(gòu)酶（isomerase）合成酶（synt

10、hesase）或連接酶（ligase） 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號(hào)蛋白類酶的分類與命名蛋白類酶的分類與命名酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名系統(tǒng)名、慣用名慣用名。系統(tǒng)名系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化還原酶氧化還原酶慣用名慣用名：只取一個(gè)較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。乳酸：乳酸：NAD+氧化還原酶氧化還原酶乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶對(duì)于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。l氧化氧化- -還原酶催化氧化還

11、原酶催化氧化- -還原反應(yīng)。還原反應(yīng)。l主要包括脫氫酶主要包括脫氫酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。l如乳酸如乳酸(Lactate)(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。l AH AH2 2+B=A+BH+B=A+BH2 2(1) (1) 氧化還原酶氧化還原酶 OxidoreductaseOxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHl轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一

12、個(gè)底物的分子上。團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如，例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。l AB+C=A+BC AB+C=A+BC(2) (2) 轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶 TransferaseTransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHOl水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。l主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。l例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：催化的脂的水解反應(yīng)：l A

13、B+H AB+H2 2O=AOH+BHO=AOH+BH(3) (3) 水解酶水解酶 hydrolasehydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHl裂合酶是催化一個(gè)化合物裂解成為兩個(gè)較小裂合酶是催化一個(gè)化合物裂解成為兩個(gè)較小的化合物及其逆反應(yīng)的一類酶。的化合物及其逆反應(yīng)的一類酶。l主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。l例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。l AB=A+B AB=A+B(4) (4) 裂合酶裂合酶 LyaseLyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOHl異構(gòu)酶催化各

14、種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。l A=B A=B(5) (5) 異構(gòu)酶異構(gòu)酶 IsomeraseIsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOHl合成酶，又稱為連接酶，能夠催化合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATPATP分解分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。反應(yīng)相互偶聯(lián)。lA + B +

15、 ATP =A A + B + ATP =A B + ADP +Pi B + ADP +Pi l例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸丙酮酸 + + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸(6) (6) 合成酶合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or Synthetase核酸類酶（核酸類酶（R R酶）的分類酶）的分類 l自1982年以來，被發(fā)現(xiàn)的核酸類酶越來越多，對(duì)它的研究越來越廣泛和深入。但是對(duì)于分類和命名還沒有統(tǒng)一的原則和規(guī)定。l根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，可以將R酶分為剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三類。l根據(jù)R酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，可分為錘頭型R酶

16、，發(fā)夾型R酶，含I型IVS 的R酶，含II型 IVS 的R酶等。l根據(jù)酶催化的底物是其本身RNA分子還是其它分子，可以將R酶分為分子內(nèi)催化（in cis，也稱為自我催化）和分子間催化（in trans）兩類。 回本章目錄（一）酶的化學(xué)本質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)。1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)不僅表明酶不一定都是蛋白質(zhì)，還促進(jìn)了有關(guān)生命起源、生物進(jìn)化等問題的進(jìn)一步探討。1.4 酶

17、的化學(xué)性質(zhì)與催化特性酶的化學(xué)性質(zhì)與催化特性（二）酶的組成（二）酶的組成酶單純酶單純酶結(jié)合酶結(jié)合酶（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子輔因子輔因子輔酶輔酶 與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔基輔基 與酶蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑金屬激活劑 金屬離子作為輔助因子。酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。（三）單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物（三）單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物1.單體酶（單體酶（monomeric enzyme)：僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水

18、解反應(yīng)。2.寡聚酶寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由幾個(gè)或多個(gè)亞基組成，亞基牢固地聯(lián)在一起，單個(gè)亞基沒有催化活性。亞基之間以非共價(jià)鍵結(jié)合。3.多酶復(fù)合物多酶復(fù)合物 (multienzyme system)：幾個(gè)酶鑲嵌而成的復(fù)合物。這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng)。丙酮酸脫氫酶系（丙酮酸脫氫酶系（E.coliE.coli）：丙酮酸脫氫酶（）：丙酮酸脫氫酶（E E）、）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（E E）和二氫硫辛酰脫氫酶（）和二氫硫辛酰脫氫酶（E E）。）。EEE堿性EEE+EE+脲(四四) 活性部位和必需基團(tuán)活性部位和必需基團(tuán)必需基團(tuán)必需基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修

19、飾使其改變，則酶的活性喪失。活性部位活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性部位維持酶的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)專一性催化性質(zhì)酶的活性中心酶的活性中心(active center)又稱活性部位又稱活性部位(active site)，具有特定空間結(jié)構(gòu)，具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。酶作用的專一性相對(duì)專一性相對(duì)專一性（族（基團(tuán)）專一性）（族（基團(tuán)）專一性）絕對(duì)專一性絕對(duì)專一性(五五) 酶作用的專一性酶作用的專一性相對(duì)專一性：可作用于一類或一些結(jié)構(gòu)很相似的底物。相對(duì)專一性：可作用于一

20、類或一些結(jié)構(gòu)很相似的底物。絕對(duì)專一性：只能作用于某一底物。酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高1081020倍，倍，比一般催化劑高比一般催化劑高1071013倍。倍。2H2O22H2O + O21mol過氧化氫酶過氧化氫酶 5106molH2O21mol離子鐵離子鐵 610-4molH2O2(六六)酶促反應(yīng)具有極高的效率酶促反應(yīng)具有極高的效率 酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。在酶的應(yīng)用過程中，必須控制好各種環(huán)境條件，以充分發(fā)揮酶的催化功能。(七七) 影響酶催化的各種因素影響酶催化的各種因素1、底物濃度的影響影響酶催

21、化作用的因素VmaxS Km + S S：底物濃度底物濃度V：不同不同S時(shí)的反應(yīng)速度時(shí)的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度最大反應(yīng)速度(maximum velocity) m：米氏常數(shù)米氏常數(shù)(Michaelis constant) 2 2 酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響當(dāng)當(dāng)SE，酶可被，酶可被底物飽和的情況下，反底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：關(guān)系式為：V = K3 E0 V E 當(dāng)當(dāng)SE時(shí)，時(shí)，Vmax = k3 E 酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 q雙重影響雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的

22、本質(zhì)是蛋白質(zhì)，升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低而反應(yīng)速度降低 。 3、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響q最適溫度最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。環(huán)境溫度。* * 低溫的應(yīng)用低溫的應(yīng)用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度溫度 C 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 4、pH對(duì)反應(yīng)速度的影響對(duì)反應(yīng)速度的影響q最適最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境時(shí)的環(huán)境pH。0

23、酶酶活活性性 pH pH對(duì)某些酶活性的影響對(duì)某些酶活性的影響 246810pH對(duì)酶作用的影響機(jī)制對(duì)酶作用的影響機(jī)制：1.環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活；2.影響酶活性基團(tuán)的解離；3.影響底物的解離。5、抑制劑的影響、抑制劑的影響酶的抑制劑酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 變性變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 區(qū)別于酶的變性區(qū)別于酶的變性 抑制劑對(duì)酶有一定選擇性抑制劑對(duì)酶有一定選擇性 引起變性的因素對(duì)酶沒有選擇性引起變性的因素對(duì)酶沒有選擇性(八八)酶活性測(cè)定和酶活性單位酶活性測(cè)定和酶活性單位回本章目錄酶的活性酶的活性酶促反應(yīng)速度酶促反應(yīng)速度可在適宜的反應(yīng)條件下，用單位時(shí)可在適宜的反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量來表示。間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量來表示。 酶的活性單位酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（映在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時(shí)間（s s、minmin或或h h）內(nèi)生成一定量（）內(nèi)生成一定量（mgmg、gg、molmol等）的等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量