1、微生物挑戰(zhàn)性實驗方法 企業(yè)名稱文件編號版本/修改號1.0文件名稱微生物挑戰(zhàn)性試驗操作規(guī)范Standard Operation Procedure for Hygiene Standard生效日期2010/7/1頁    次第1頁 共6頁編寫 審核 批    準(zhǔn)  1.0目的新產(chǎn)品防腐效果的測試2.0 范圍公司新產(chǎn)品3.0參考：4 材料與方法4. 1化妝品中常用的防腐體系 6營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、0.9%氯化鈉溶液、平皿、接種環(huán)、培養(yǎng)箱等4. 2微生物挑戰(zhàn)性

2、實驗4. 2. 1受試用微生物    測試用細(xì)菌和霉菌均由浙江省食品和藥品檢驗所提供。細(xì)菌包括: 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、巨大芽胞桿菌、綠膿桿菌。霉菌包括: 黑曲霉、黃曲霉、變色曲霉、桔青霉、擬青霉、臘葉芽枝霉、球毛殼霉、綠色木霉。    實驗前，將各菌種接種于合適的培養(yǎng)基中, 于 37( 細(xì)菌) 或28( 霉菌) 下培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)在2天后, 霉菌培養(yǎng)在3-5 天后，挑選適量菌落于滅菌的生理鹽水中，制成一定濃度的混合細(xì)菌( 1×108 個/ ml) 或混合霉菌懸液( 1×107個/ ml) , 置于4貯

3、放備用。4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑戰(zhàn)試驗    此方法參照美國藥典( 第2 1 版) 上微生物挑戰(zhàn)性試驗檢測防腐劑效果的方法。稱取各受試樣品30g, 加入混合細(xì)菌或混合霉菌懸液, 每克受檢膏霜最終含菌量分別為5×106個細(xì)菌和3 ×105個霉菌。然后充分混勻, 置于28下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取樣分析: 準(zhǔn)確稱取3g樣品, 加到含有玻璃小珠的滅菌錐形瓶內(nèi), 加入27ml滅菌生理鹽水, 充分震蕩混勻, 此懸液為110稀釋液；然后再用滅菌生理鹽水按10倍依次稀釋。按平板傾注法計數(shù)受試品中含菌量, 細(xì)菌培養(yǎng)是37 下2

4、4h48h，霉菌培養(yǎng)為28下35 天。此實驗用以評判防腐劑的有效與否。評判標(biāo)準(zhǔn)為: 當(dāng)每克樣品中一次接菌( 1×106細(xì)菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量減少至不高于起始濃度的0. 1%, 以后逐漸減少, 在28 天為0 。符合標(biāo)準(zhǔn)為防腐劑有效( 通過測試) , 不符合為防腐劑無效(不通過測試)。分析與檢測4. 2. 3重復(fù)3 次加菌的微生物挑戰(zhàn)試驗此方法參照國際CT FA（國際化妝品、香精和洗滌劑協(xié)會）推薦的微生物挑戰(zhàn)性試驗。稱取受試樣品30g , 每隔2 周加菌一次( 即實驗的第1、3 和5 周) , 每次加細(xì)菌量為1 ×106 1 ×1

5、07個/ g 樣品和霉菌1×105個/ g1×106 個/ g  樣品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采樣分析樣品中含菌量, 方法同前。此方法可將受檢樣品分為三類:( 1)防腐效果優(yōu)良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天時, 存活菌量減少至不高于起始濃度的0. 01% ( 即100 個/ g或ml） 樣品, 通過測試) 。( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天時, 存活菌量減少至不高于起始濃度的0. 1%, ( 即1000 個/ g 或mL 樣品, 通過測試) 。( 3

6、)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天時, 存活菌量>mL樣品(不通過測試) 。5、結(jié)果判斷    受試樣品一次加菌和3 次加菌后, 在檢測時間內(nèi)細(xì)菌和霉菌的抗腐能力見表14。根據(jù)兩種方法評判標(biāo)準(zhǔn), 將8 種防腐體系的防腐效果評判列于表5 。從結(jié)果看, 兩種加菌方法對防腐體系的評判結(jié)果基本一致, 三次加菌還可對有效的防腐體系作出程度之區(qū)別: 防腐優(yōu)良( W: We      pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后12 周內(nèi)能將樣品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通過3