1、血管平滑肌細(xì)胞的增殖及西洋參葉二醇組皂甘的干 預(yù)作用（一）作者：邵偉袁曉波王智昊趙學(xué)忠【摘要】目的觀察西洋參葉二醇組皂甘（PQDS對增殖的血管平滑肌細(xì)胞 （VSMC的干預(yù)作用，探討PQDSF預(yù)VSMC勺增殖作用及機(jī)制。方法 組織貼塊 法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMC用AngII誘導(dǎo)VSMCI殖。隨機(jī)分為：空白對照 組、AngII 模型組、AngII +PQDS 100 50、25 mg/L 不同劑量組。用 MTTt、流 式細(xì)胞術(shù)觀察PQDS寸細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、增殖指數(shù)的影響。結(jié)果PQDS可減低VSMC勺增殖能力，將增殖的 VSMC卬制在G0/G1期。結(jié)論P(yáng)QDSfg抑制VSMC 增殖，其機(jī)制可能與

2、將增殖的 VSMC卬制在G0/G1期有關(guān)。【關(guān)鍵詞】 西洋參葉二醇組皂甘；血管平滑肌細(xì)胞；血管緊張素II冠狀動脈粥樣硬化（AS）的主要病理變化是血管平滑肌細(xì)胞（VSMC的增殖 1,2。誘導(dǎo)VSMC曾殖因素有很多，其中較重要的因素為血管緊張素R （AncjH）。AngR是腎素 血管緊張素系統(tǒng)（RAS中重要的生物活性肽，經(jīng)過一系列細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖3。西洋參葉二醇組皂甘（PQDS是五 加科人參屬植物，有抗心肌缺血、縮小心肌梗死面積的作用4。目前尚未有文獻(xiàn)報道PQDSt VSMC曾殖的影響，本文就PQDSt VSMC曾殖的干預(yù)作用進(jìn)行 研究。1材料與方法1.1 試劑及材料Wistar 大鼠

3、3只，雄性，120150 g。PQD舫末、AngH （ Sigma公 司），胎牛血清FBS RPMI1640W養(yǎng)基、Trizol （Gibco公司），兔抗大鼠平 滑肌肌動蛋白（a SMA）（美國Lab vision 公司），S P抗兔試劑盒、DAB 顯色試劑盒（中杉金橋生物工程有限公司），MTT碘化丙錠、RNAB （Sigma分裝）。1.2 VSMC的培養(yǎng)及鑒定用組織貼塊法進(jìn)行中層VSMCS養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%Z上時，傳代 培養(yǎng)，取第36代培養(yǎng)物，經(jīng)兔抗大鼠a SWA免疫組化染色鑒定，陽性細(xì)胞 >98% 證實培養(yǎng)的是 VSMC實驗用510代VSMC1.3 分組將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，

4、空白對照組：正常 VSM（fi; AngII模型組：AngII 10-7 mol/L , PQDS（齊1J量組（PQDS1 : PQDS 100 mg/L+ AngII 10-7 mol/L ;PQD即齊I量組(PQDS2： PQDS 50 mg/L+ Ang H 10-7 mol/L ; PQDS氐齊量組 (PQDS3： PQDS 25 mg/L+ AngH 10-7 mol/L ;以上各組細(xì)胞置于含 10%臺牛血清的RPMI164g養(yǎng)液中，于5%CO2 37C、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含 10%|臺牛血清的RPMI164

5、g養(yǎng) 液配成單細(xì)胞懸液，以每孔103104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積 為200小。將培養(yǎng)板放入CO綱箱中37C、5% CO級飽和濕度條件下，培養(yǎng) 24 h,待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。按照上述分組中的給藥，各組細(xì)胞在 10%|臺牛血清的RPMI1640e養(yǎng)液，于CO2ff箱中37C、5%CO及飽和濕度條件 下，培養(yǎng)48 h0棄去培養(yǎng)液，每孔加入 MTT容72 20屋，37c繼續(xù)培養(yǎng)4 h后 終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加 150屋 二甲基亞楓(DMSO,振蕩10 min。然后選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及增殖指數(shù)將細(xì)胞

6、接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng) 24 h ,后換無血清RPMI164g養(yǎng)液作用24 h,使細(xì)胞同步化于G0期。按前述分組方案加藥處理后，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h ,然后 收集細(xì)胞，離心1 000 r/min X5 min,棄上清。用4c預(yù)冷的70燼乙醇固定 18 h ,之后調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106細(xì)胞/ml , PI染色37c孵育30 min后進(jìn)行 流式分析，應(yīng)用ModFit LT3.0軟件分析細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分 率；計算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI) , PI= (S+G2/M / (G0/G1+S+G2/M。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSSt件進(jìn)行統(tǒng)計處理，所有計量數(shù)據(jù)以 x±s表示，采

7、用單因素方 差分析(ANOVA、SNK僉驗進(jìn)行差異的統(tǒng)計學(xué)處理。2結(jié)果2.1 VSMC的鑒定用倒置相差顯微鏡和SMAfe疫組化染色，對VSMGS行鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)3 5d后，用相差顯微鏡觀察可見少量細(xì)胞自組織塊邊緣游離出來，細(xì)胞呈梭形 或長梭形排列，然后細(xì)胞呈放射性生長，長軸與組織塊邊緣垂直，多為兩極， 胞漿均勻，可見圓形細(xì)胞核及分裂相。至培養(yǎng) 10 d左右出現(xiàn)局部成束的細(xì)胞平 行排列，部分區(qū)域細(xì)胞重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰、谷”狀生長。SMAfe色發(fā)現(xiàn)98%勺細(xì)胞染色呈陽性，即細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色反應(yīng)，胞核不著色，表 明細(xì)胞含有SMA證明培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC見圖1。2.2 PQDS對VSMCI

8、殖能力的干預(yù)Angll模型組 OD值(0.862 5 ±0.06)比空白對照組(0.791 3 ±0.04)明顯升 高(P0.05),提示AngH可促進(jìn)VSMC勺增殖，造模成功。PQDS、中劑量組ODfi（0.773 8 ±0.05, 0.807 5 ±0.03）比 Angll 模型組均顯著降低（P0.05）, PQD慈劑量組（0.812 5 ±0.06）有下降趨勢，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）,提示PQDStg夠才制VSMC曾殖。2.3 PQDS對VSMC勺細(xì)胞周期及PI的干預(yù)Angll模型組較空白對照組 G0/G1期VSM3分率

9、明顯減少（P0.05） , S 期、G2/M期VSMCT分率顯著增加（P0.05）,增殖指數(shù)明顯升高（P0.05）。 提示AngH可以促進(jìn)VSM（U G1/G0期向S期轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)VSMCI殖，造模成 功。PQD的物組較Angll模型組G0/G1期的VSM3分率均顯著增加（P0.05） ; S期的VSMCT分率、增殖指數(shù)均顯著減少（P0.05） ; PQDS（、中 劑量組G2/M期VSMCT分率顯著降低（P0.05）,低劑量組G2/M期百分率降 低，但沒有明顯差異（P>0.05）。上述結(jié)果顯示PQDSF預(yù)Angll誘導(dǎo)的VSMC 增殖，主要將細(xì)胞抑制在 G1/G0期，見表1。表1 PQDS

10、寸細(xì)胞周期及增殖指數(shù) 的影響（略）3討論目前臨床上抑制VSMC曾殖的藥物有鈣離子拮抗劑、B受體阻斷劑、血管緊張 素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、免疫抑制劑雷帕霉素、降脂藥普羅布考等5，但抑制VSM豌殖的中藥開發(fā)得較少。中藥是祖國醫(yī)藥的神奇寶藏，在中醫(yī)整體理論的 指導(dǎo)下，可發(fā)揮多靶點、多成分協(xié)同作用的優(yōu)勢，療效顯著、價格低廉、毒副 作用小。因此，開發(fā)抑制 VSMC曾殖的安全有效的中藥及探討抑制 VSMC曾殖的 機(jī)制有重要意義。AncjH是腎素 血管緊張素系統(tǒng)中最重要的生物活性肽，不僅是血管活性物 質(zhì)引起機(jī)體血流動力學(xué)改變，而且通過自分泌、旁分泌刺激VSMC曾殖6。本實驗用Angll誘導(dǎo)VSMCI殖，MTTt觀察

11、到Angll模型組OCfi比空白對照組 明顯增高，說明AngR促進(jìn)VSMCI殖，表明實驗造模成功。本文通過流式細(xì)胞 儀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Angll使G0/G1期的VSMCT分率明顯減少，S期、G2/M期的 VSMCT分率明顯增加。證實 Angll促使VSM縱G0/G1期進(jìn)入到S期、G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。西洋參莖葉皂甘（PQS系五加科人參屬植物，包括 PQDS口三醇組皂甘 等。研究證明PQDST增加急性心肌梗死犬心肌血流量，降低冠脈阻力，明顯降 低心肌耗氧量、心肌氧攝取率及心肌耗氧指數(shù)7，可增加小鼠心肌Rb攝取 率，增加心肌營養(yǎng)性血流量8，可明顯縮小心肌梗死面積，減少血清中肌酸 磷酸激酶（CPK及

12、乳酸月氫酶（LDH 活性9。本實驗證明PQDS寸VSMC 增殖有抑制作用。PQDS! OCfi明顯比Angll組減低，說明PQDST抑制細(xì)胞增 殖。PQD骼組可增加G0/G1期VSMC勺百分率，減少S期、G2/M期VSMC勺百分 率，減少增殖指數(shù)，阻斷細(xì)胞由 G0/G1期向DN給成的S期、G2/M期轉(zhuǎn)化。說 明PQDST抑制VSMC勺增殖，可將VSMC田胞抑制在G0/G1期，進(jìn)而證明PQDS 通過抑制VSMC曾殖而起到對AS的防治作用。【參考文獻(xiàn)】1 Campbell JH, Campbell GR. Culture techniques and their applications to s

13、tudies of vascular smooth muscleJ. Clin Sci,1993； 85:501 13.2 Locher R, Emmanuele L, Paolo M , et al.Green tea polyphenols inhibit human vascular smooth muscle cell proliferation stimulated by native k)w density hpoproreinJ.Eur J Pharmacol, 2002； (434)：1 I3 Owens GK.Regulation of differentiation of vascular smooth muscleJ. Physiol Rev,1995; 75：M 517./1 恥Ikn. 1：, Gojovci.廂.rchiol口uvrHgault C, et al. Inhibition0f TTc.nsforin-ng growth factor p signaling acceleratesatherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in miceJCirc Res,