1、王草莖點(diǎn)霉葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性【摘要】：p ：針對(duì)在廣西橫縣發(fā)生的一種王草葉斑病害，為明確其病原種類，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定，并研究其生物學(xué)特性。結(jié)合致病菌的形態(tài)特征以及ITS序列系統(tǒng)聚類分析p 結(jié)果，將其鑒定為草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）。生物學(xué)特性研究表明：該菌菌絲體適宜生長(zhǎng)的溫度為2032 ，最適溫度為2528 ；菌絲體生長(zhǎng)的最適pH值為58；菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳為葡萄糖、蔗糖和甘露醇；最佳氮為蛋白胨，而尿素則不適合菌絲體生長(zhǎng)；光/暗交替或暗/光交替均有利于菌絲體生長(zhǎng)；菌絲體致死溫度為50 ，10 min。【關(guān)鍵詞】：p ：王草；莖點(diǎn)霉；病原鑒定；ITS；生

2、物學(xué)特性中圖分類號(hào)： S435.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（20_）06-0210-05收稿日期：20_-02-06資助項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng) （編號(hào)：20_03057）。作者簡(jiǎn)介：張馳成（1992），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草病害調(diào)查及病原鑒定等研究。E-mail：cczhang1992126.。通信作者：賀春萍，碩士，副研究員，從事橡膠樹(shù)根病的拮抗菌篩選等研究，E-mail：hechunppp163.；易克賢，博士，研究員，從事熱帶牧草、劍麻和蘆筍真菌病害與抗性遺傳育種研究，E-mail：yike_ian126.。王草（Pennisetum

3、）別稱皇草、皇竹草，是以象草為母本、美洲狼尾草為父本雜交（Pennisetum purpureum×P.americanum）育種而成1。我國(guó)于1982年由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院從哥倫比亞引進(jìn)，經(jīng)過(guò)多年試種選育而成，后定名為熱研4號(hào)王草（Pennisetum purpureum×P.americanum cv.Reyan No.4）2。王草為多年生牧草，具有產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快、抗倒伏、耐干旱、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，而且莖葉柔軟口感好，營(yíng)養(yǎng)豐富，以優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)而著稱，被譽(yù)為“草中之王”3，是各種草食性牲畜和魚(yú)類的優(yōu)質(zhì)飼料。適宜在我國(guó)熱帶及亞熱帶種植，目前已經(jīng)在海南、廣東、廣西、云南等地成功種

4、植，是華南地區(qū)最適于集約化栽培的刈割型禾本科牧草4。然而，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大以及種植年限的延長(zhǎng)，各種病害逐漸發(fā)生并逐年加重，很大程度上限制了包括王草在內(nèi)的牧草產(chǎn)量及質(zhì)量5-6。牧草病害可使牧草生長(zhǎng)量減少，產(chǎn)草量降低，營(yíng)養(yǎng)成分含量和可消化率下降，有害物質(zhì)含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物日增體質(zhì)量減少7。王草作為南方主要熱帶牧草之一，同樣面臨多種病害尤其是真菌病害的影響。20_年5月，在廣西橫縣出現(xiàn)了成片王草大規(guī)模發(fā)生葉斑病的情況，且有迅速蔓延之勢(shì)。為明確其病原，本試驗(yàn)通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)檢查，結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)該致病菌進(jìn)行了鑒定，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，以期為當(dāng)?shù)赝醪萑~斑病害的發(fā)生及綜合防治提供理

5、論依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1 供試菌株從廣西橫縣熱研4號(hào)王草上采集病樣，經(jīng)室內(nèi)無(wú)菌條件下分離及單孢分離純化得到供試菌株。1.1.2供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20_g，葡萄糖1520 g，瓊脂1520 g，ddH2O定容至 1 000 mL，自然pH值；查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂1520 g，無(wú)菌水定容至1 000 mL。上述培養(yǎng)基均于121 高壓滅菌20 min后備用。1.1.3試劑及儀器真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）通用引物 ITS1

6、（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3）由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。Taq酶、PCR buffer、dNTPs、DNA片段回收試劑盒及T1載體等均購(gòu)自北京全式金生物試劑公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析p 純。1.2方法1.2.1病樣采集及病原菌分離純化采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離純化8。將田間采回的發(fā)病王草葉片沖洗干凈、晾干，在病健交界處剪取（23） mm×（23） mm的組織塊。于超凈工作臺(tái)中，首先用0.1% Hgcl2溶液消毒約 1 min，然后用75%乙醇漂洗30 s，經(jīng)無(wú)菌水漂洗23次后用

7、滅菌濾紙吸干，置于PDA培養(yǎng)基中，在25 條件下培養(yǎng)23 d。待菌落長(zhǎng)出后，從其邊緣挑取菌絲塊，置于平板PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，獲得分離菌株。1.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定將分離純化得到的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 培養(yǎng)67 d，期間觀察并記錄菌落在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況；在顯微鏡下觀察菌絲體與分生孢子的形態(tài)，測(cè)量分生孢子的大小，并拍照保存。1.2.3病原菌致病性測(cè)定取健康王草嫩葉，先用無(wú)菌水洗干凈，再經(jīng)75%乙醇消毒，并再次用無(wú)菌水沖洗后晾干。將直徑5 mm的菌餅接種于經(jīng)消毒針頭刺傷的葉片（菌絲面緊貼在葉片傷口處），每葉接種2塊菌餅，重復(fù)處理3個(gè)葉片，接種無(wú)菌培養(yǎng)基塊作為對(duì)照。于托盤(pán)內(nèi)保濕

8、。接種2 d后開(kāi)始觀察發(fā)病癥狀，3 d后除去菌絲塊，記錄病斑大小和顏色。待接種葉片發(fā)病后，按照柯赫氏法則，從病部再分離病原菌，觀察所得分離物與原接種病原菌的形態(tài)特征是否一致。1.2.4病原菌分子生物學(xué)鑒定1.2.4.1病原菌基因組DNA的提取和 PCR 擴(kuò)增用真菌DNA提取試劑盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供試菌株DNA，于超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，其余的DNA溶液置于-20 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ靡颕TS1/ITS4對(duì)其rDNA的2個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)和5.8S區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)體系體積為20 L：10×PCR反應(yīng)緩沖液2 L，dNTPs （10 mmol/L） 1.6 L，引物ITS1和ITS4 （10 mol/L）各0.5 L，Taq DNA聚合酶（5 U/L） 0.2 L，DNA模板 1 L，ddH2O補(bǔ)足20 L。用雙蒸滅菌水代替模板DNA作陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf Mastercyler gradient）上進(jìn)行。擴(kuò)