1、淺談阿斯匹林類藥物和旳晶體蛋白保護酯酶的失活【關鍵詞】 布洛芬關鍵詞：a-晶體蛋白;阿斯匹林;布洛芬;酯酶;糖化;氨甲酰化;類固 醇摘要:目的 研究阿斯匹林類藥物和a晶體蛋白對酯酶的保護作 用.方法 凝膠色譜分離牛a晶體蛋白，酯酶分別與糖類、磷酸糖、 氤酸鉀和激素加阿斯匹林（asp）、布洛芬（ibu）、撲熱息痛（para） 和a-晶體蛋白溫育，采用分光光度法測定酶活性.結果糖化、氨甲 酰化和類固醇誘導酯酶失活的作用呈濃度依賴性，類固醇失活效應最 快.lommol l-l asp可部分保護果糖和類固醇誘導酯酶的失活，盡管 ibu抑制酶活性，但其竣基化（ibul）和疑基化（ibu-2）代謝物有保

2、護作用.a-晶體蛋白與酯酶摩爾比為1 1時，可完全特異地保護果糖、 果糖6磷酸和潑尼松龍21 半琥珀酸誘導的酯酶失活;而在1 4時，保 護率分別為67.0%, 55.0%和38.3%結論asp和ibu保護酯酶免于 失活的作用機制可能不同;a-晶體蛋白作為分子伴侶可保護酯酶免于 失活.keywords: a-crystall in ;aspirin ;ibuprofen ;esterase;glyca-tion;carbamy lation;steroidabstract:aim to investigate the protection effect of as-pirin-like drug

3、s anda-crystallin on inactivation of esterase by glycation.methods bovinea-crystallin was isolated by gel chromatography.esterase were incubated with sugars, sugar phosphate, potassium cyanate and steroid or with as-pirin, ibuprofen, paracetamol anda-crystallin respectively.the enzyme activities wer

4、e assayed by the spectroptnmete匚results inactivation of esterase was induced by glycation, carbamylation and steroid in a concentratiodependant manne匚steroid displayed a more rapid inactiva-tion effect than others. lommol l-l aspirin partially pro-tected esterase against inactivation by fructose and

5、 steroid.although ibuprofen inhibited esterase, its carboxylated (i) and hydroxylated (ii) metabolites showed a limited protec-tion.a-crystallin fully protected esterase against inactivation by fructose , fructose6-phosphate and prednisolone-21 -hemisucciate at a molar ratio ofl 1, but only to the e

6、xtent of67.0% , 55.0%and38.3%of activity at a molar ratio ofl 4respectively.conclusion aspirin and ibuprofen may play a different role in protection enzymes against inactiva-tion.acrystallin acts as a molecular chaperone to protect es-terase against inactivation.0引言臨床流行病和實驗研究表明阿斯匹林類藥物作為非笛體類抗炎 藥，可預防和

7、治療口內障等一類結構性疾病(conformational disease) .a-體蛋白分子伴侶(molecular chaperone)功能的發現， 為白內障發病機制的研究提供了新的理論依據糖化、氨甲酰化和長 期大量應用激素等是白內障發病的主要危險因素1-3 酯酶具有重 要的生理功能，糖尿病患者、實驗性大鼠血漿及老年性白內障晶狀體 中酯酶活性下降，可能在糖尿病并發癥和老化病程中起重要作用 4-7 我們通過觀察阿斯匹林類藥物和*晶體蛋白對酯酶的保護 作用，探討口內障的發病機制和潛在的治療途徑.1材料和方法1.1材料 酯酶(豬肝臟竣酸酯酶ec)、核糖、果糖、6- 磷酸葡糖(g6p)

8、、髄 6.磷酸、葡萄糖、氤酸鉀、潑尼松龍21-半琥 珀酸(p-21-h)>阿斯匹林(asp)、布洛芬(ibu)和撲熱息痛(para)> 牛血清白蛋白和雞蛋溶菌酶等均為sigma公司產品ibu的兩種主要代 謝物2- 4 (2-竣丙烷基)苯基丙酸菌素酸(ibu-1)和2- 4 (2- 甲基2輕內烷基)苯基內酸菌素酸(ibu-2)由shyadehi等8提 供凝膠柱sephacryl s-300hr為phamacia公司產品.1.2方法1.2.1 *晶體蛋白分離和純化98只1.5歲新鮮牛透明晶狀體去囊膜，分離皮質和核，勻漿(0.05mol l-1磷酸鈉緩沖液、0.2mol l-1 kc1,

9、 lmmol l-1 edta, lmmol l-1 egta;ph6.7),混合物以 22440g 離心40min.采用凝膠柱sephacryl s-3oohr分離品狀體結構蛋白(凝 膠柱100cmx2.3cm,淋 25mlh-l )，根據色譜圖分別收集ah , al , 陽，卩l和丫晶體蛋白，透析24h,低溫冷凍干燥，20°c儲存備 用.sds-page檢測a-晶體蛋白的純度.1.2.2酶溫育和活性測定7酉酶(5iu,3o.3)ig)溶解t 50mmol l-1磷酸鈉緩沖液(ph6.8),首先與果糖(0.45, 0.9, 5, 10和20mmol l-1 )溫育，其中20mmol

10、 l-1為糖基化適宜濃度，并分別與20mmol-1的核糖、g6p、葡萄糖、果糖6-w(5, 10和20mmol l-l );氧酸鉀(10, 20, 5()和 loommol l-l ), p-21 -h (1, 2, 5 和 lommol l-l )混合并通過0.2pm微孔過濾器，分裝于消毒小玻璃瓶，37°c水 孵箱振動溫育113d.酶活性測定以酯酶催化p硝基苯醋酸(pnpa) 的水解率來表示首先將pnpa溶解于乙月青屮配成60mmol l-l的儲備 液,以防止水解lml的pnpa與50mmol l-l磷酸鈉緩沖液(ph6.8) 19ml混合，取iml稀釋液與0.2ml酶溶液混合于1

11、.4ml的比色杯 中，28°c下，通過檢測100s內400nm光吸收酶水解降率來測定酯酶 的活性阿斯匹林類藥物與酯酶的溫育lommol l-l的asp, ibu 和para與酯酶混合，分別加或不加20mmol l-1果糖、lmmol l-l p-21-h和50mmol l-l氧酸鉀水振動孵育7d;酯酶與 lommol l-l ibu, 5 或 lommol l-l ibu-1 和 ibu-2 混合溫育.第6 h,在微過濾前用50mmoll-l磷酸鈉緩沖液(ph6.8)沖洗14次，離心(6000g, 5min),并分別檢測酶活性.jiff1.2.4 a-晶體蛋白與酯酶的溫

12、育a晶體蛋白(3.4, 6.7和13.4mgl-l )和對照蛋口分別與酯酶混合后，加或不加20mmol l-l果糖、 lommol l-l 果糖 6磷酸、50mmol l-l 氧酸鉀、lmmol l-l p-21-h, 1 ommol l-l ibu和para水振動溫育7d,分別檢測酶活性，并與正常 對照比較，以百分比表示*晶體蛋白的分子伴侶活性.統計學處理:結果均采用student t檢驗.2結果1酯酶的穩定性酯酶(30.3|ig)溶解于50mmol l-1磷酸鈉緩 沖液(ph6.8),室溫下放置id,酶活性穩定;37°c水孵箱振動溫育6 和10d,酶活性分別下降(8.2±

13、;3.6) %和(9.4±2.8) %.2糖化誘導的酯酶失活溫育5d,果糖(0.45, 0.9和5.0mmol l-1 )并未明顯導致酶失活.20mmol l-1果糖和核糖具有快速糖基化 作用,溫育2d,殘留酶活性分別為(70.7±4.7) % (p二0.0019)和 (60.8+5.7) % (p=0.0099) g6p和葡萄糖為緩慢抑制作用,溫育7d, 酶活性分別為(65.7±3.5) % (p=0.0043)和(87.6+5.2) % (p=0.0564); 溫育13d,葡萄糖組才有統計學意義(p=0.0039) (figi) 果糖6磷 酸表現為時間濃度依賴

14、性酶失活效應，溫育3d, 10mmoll-l果糖6 磷酸已使酶失活差異具有顯著性.圖1糖化誘導酯酶的失活略3氨甲酰化和激素誘導酯酶失活p-21-h (5和1 ommol l-1 ) 迅速失活酶，甚至1和2mmol l-1在溫育2d時，已顯著失活酶，殘 留酶活性分別為(75.6±7.2)%(p=0.0278)和(74.2±3.9) % (p=0.0074) (fig2) 盡管使用較高濃度(20, 50和100mmolll ),孰酸鉀對酶 失活作用仍較弱.50mmol l-1氤酸鉀溫育2和4d,殘留酶活性分別為 (59.4±9.8) % (p=0.0470)和(39.

15、5±4.6) % (p=0.0002)4 tbu和para抑制酯酶活性 溫育前1 ommol l-1的ibu已表現抑 制酶活性，與對照比較殘留活性為(46.3±3.2) % (p=0.0012),這中 抑制作用進展緩慢;溫育5d,酶活性為(31.710.4) % (p二0.0001).溫育6d,過濾后仍保留40.0%的酶活性，沖洗1或4次之間無統計學差異.para表現為時間依賴性抑制效應，溫育前和溫育1, 2和3d,1 ommol l-1的 para 使酶活性僅剩余（85.7土&5） % （p二0.0991）,jiff(52.4±3.1) % (p=0.0

16、042), (16.7±5.9) %(p=0.0017)和(10.8+2.2) %（p=00002） 而1 ommol l-1的asp溫育5d,并未造成顯著的酶活 性喪失.5 asp, ibu- 1和ibu-,2對酯酶的保護作用asp,竣化的ibu-1 和羥化的ibu-2可保護果糖和p-21-h誘導酯酶的失活（tabl）.溫育 3d后，1 ommol l-1的asp保護p-21-h誘導酯酶的失活有顯著性差 異（p=00024） ; 1 ommol l-1 的 ibu-1 和 ibu-2 分別保護果糖和 p-21-h 誘導酯酶的失活具有統計學意義.圖2氨甲酰化和皮質激素誘導酯酶失活略表

17、1 asp和ibu-1/ibu-2對果糖和p-21-h誘導酯酶失活的保護作用略圖3 %品體蛋白保護果糖6磷酸誘導酯酶的失活 略6 a晶體蛋白保護酯酶的失活 與對照蛋白比較，ct晶體蛋白與 酯酶分子摩爾比為1 1時，可特異地完全保護果糖、果糖6磷酸和 p-21-h誘導酯酶的失活，而在1 4時，保護率分別為67.0%, 55.0%和38.3%溫育4d時，a晶體蛋白（1 4）可保護果糖6磷酸誘導的酯酶失活（fig3）.在溫育3和5d時,p-21-h組酶活性分別為（70.4±2.9）%和（44.5±4.9）%;加 a晶體蛋口（1 4）后，少旳（83.8±7.1 ）%（p=

18、0.0301） 和（75.2+5.3） % （p=0.0038） .a-晶體蛋白無保護氧酸鉀誘導酯酶失 活的作用a晶體蛋白（12）部分保護para抑制酯酶的失活，但對ibu 抑制作用無效，盡管溫育5和9d,牛血清白蛋白分別部分保護果糖 和果糖6-磷酸誘導酯酶失活，但均無統計學意義.3討論1974年首次報道酯酶存在于晶狀體，并已在人血清屮分離岀4種類型酯酶，但由于其生理功能復雜，因而作用機制尚不確w.kamei（1996）從正常人晶狀體可溶性蛋白質中分離純化出兩種酯酶，它們 有不同的最適ph值、溫度和km值其中酯酶i的mi為200000,jiff酯酶ii的mr為30000.隨著老化酶活性顯著下降

19、;老年性口內障晶狀 體酯酶活性與止常同齡人比較也明顯降低，提示晶狀體中酯酶活性下 降與白內障形成有密切關系：6 糖尿病患者外周血淋巴細胞和血 漿酯酶活性的下降與感染機率的增加有關4 糖化、氨甲酰化和 激素作為口內障致病因素可誘導酯酶失活，可能是通過與賴氨酸基團n端游離*氨基或氨基反應，以降低其電荷若該反應位于或靠近酶活性位點，可直接失活酶或通過結構性改變間接失活酶】1, 10晶狀體蛋白周圍存在許多活性小分子，包括糖、來源于尿屮的氧酸鹽、 糖皮質激素和具有活性的代謝產物等，這些均可在非酶環境下攻擊蛋 白質.糖化是糖的碳基團與蛋白質氨基（通常是賴氨酸或n端氨基）反應，形成schiff堿基，進而蛋白

20、質交聯，通過復雜的通路轉變成不 可逆轉的高級糖化最終產物木實驗中糖化失活酯酶的程度與其他酶 學研究類似10,即糖化強度依次為核糖果糖g6p葡萄糖英國牛 津和印度的流行病調查研究表明，嚴重的腹瀉是白內障發病的高危因 素2.腹瀉造成血中異氧酸鹽的增高可能是主要原因異氧酸是氨 甲酰化的活性物質，生理性ph條件下，氧酸鹽可逆地與蛋白質毓基 或不可逆地與氨基（主要是賴氨酸的8氨基）共價結合.隨著人的老 齡化，血中的異氧酸含量逐漸增加.p-21-h的失活作用較糖和氧酸鉀 顯著，可能由于潑尼松龍的側鏈有活化的碳酰基和醍a環，可與蛋 白質氨基020的活性碳基團反應形成schiff堿基（類似糖化），并 重組為更

21、穩定的加合物有關10 本實驗結果表明，阿斯匹林可能 通過氨乙酰化作用部分保護果糖和類固醇誘導酯酶的失活而ibu抑 制酶活性，但其竣基化（ibu-1）和甕基化（ibu-2）代謝物有保護作 用，ibu-2的作用略強于ibu-1,但差異無顯著性，可能是代謝產物增 加了其親水性的原因ibu是2手性芳基丙酸的衍生物，主要的代謝物 是ibu-1,有2個非對稱中心和1個立體同質異構體;而ibu-2有1個 非對稱中心和1對鏡像體尿中含微量1 和2耗基化ibu.po ibu后約 80.0%的兩種代謝物以成對或非成對形式存在于尿中11 .ibu可減少氧酸鉀和半乳糖與晶體蛋白的結合量2,盡管ibu和pant與晶ji

22、ff體蛋白結合量小，但ibu的親水性較強，因而其結合緊密酶學研究提 示ibu和para無保護類固醇誘導蘋果酸脫氫酶、氨甲酰化誘導6-磷 酸葡糖酸脫氫酶和類固醇誘導過氧化氫酶失活的作用，并可抑制延胡 竣酸酶和3磷酸甘油醛脫氫酶10 但動物實驗和臨床研究提示阿 斯匹林類藥物可防治白內障，它們之間存在不同的保護機制，ibu和para可能是通過其藥物前體發揮作用.a-晶體蛋白作為晶狀體主要的結構蛋白，其分子伴侶活性表現為在其他蛋口處于易感狀態吋，可保護它們免受損傷，主要是抑制各種蛋白質的凝聚和失活目前認為(x 晶體蛋白為非對稱的環形價聚合體，中央有較大的空洞，表面密度低在空洞的內或外表面，g端 序列和

23、伸展性的變化是維持a-晶體蛋白伴侶活性的重要因素10. 本結果提示1分了的晶體蛋白可部分保護4分子的酯酶特異性保 護作用可能是通過酯酶或變性的酯酶進入空洞中央,粘附于*晶體蛋 白的外表面而起作用.harding 1提出包括白內障的-類結構性疾 病具有和同的病因，就可能存在共同的治療方案17項流行病學研究 表明，若全部老年人應用阿斯匹林類抗炎藥物，約50.0%的 alzheimer9s病可預防因而阿斯匹林類藥物，具有潛在的治療白內障 和alzheimer病等結構性疾病的作用.致 謝 英國牛津大學眼科醫院shyadehi az和harding jj對木研 究給予幫助.參考文獻：1 harding

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